PCR 多聚酶链式反应 生命科学前沿 教程文件.ppt

polymerase chain reaction (PCR);一、PCR的最早设想 Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想： “经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合 酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆基因”。;1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。;Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA 聚合酶 I 的Klenow片段，其缺点是： ①Klenow酶不耐高温，90℃会变性失活，每次循 环都要重新加。 ②引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生模板和 引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差， 合成的DNA片段不均一。 这使得PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。;1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌 (thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶。 此酶具有以下特点： ① 耐高温:在93℃下反应2h后其残留活性是原来的60%。 热变性时不会被钝化。 ② 大大提高了扩增片段特异性及扩增效率和灵敏性。 此酶命名为TaqDNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。;（二）引物的退火：模板DNA经加热变性成单链后， 温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序 列配对结合；;（三）引物的延伸：TaqDNA聚合酶的作用下， 以dNTP为原料，靶序列为模板，按碱基配对 与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补链。;DNA amplification by the PCR;Second cycle;Third cycle;预变性(92-95?C,2-5m);PCR的反应动力学;一、PCR 成分 1, 模板 1pg-1μg 2, 引物 1μmol/L 3, DNA 聚合酶 1－5 u 4, dNTPs 200μmol/L 5, Mg2＋ 1.5mmol/L;模板可是PCR 的关键，模板的质量是PCR 成功的先决条件。 DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。 ;1）典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列 独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。 2）选择GC含量为40％到60％或GC的引物。 3）设计5’端和中间区为G 或C 的引物。这会增加引物的稳定性 和引物同目的序列杂交的稳定性。 4）避免引物对3’末端存在互补序列，这会形成引物二聚体， 抑制扩增。 5）避免3’末端富含GC。设计引物时保证在最后5个核苷中含??? 3个A或T。 6）避免3’末端的错误配对。3’端核苷需要同模板退火以供聚合酶 催化延伸。3’最好以G或C结尾，防止AT的松散结合引起错配。 7) 引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。 ;Fig. Agarose gel electrophoresis of PCR products from the intestinal contents of chickens. ;当50％的引物和互补序列表现为双链DNA 分子时的温度。 计算Tm 有公式。 Tm=4x(G+C)+2x(A+T)-5 以上算法都是基于碱基组成而不是碱基排列而计算的，事实上相同碱基组成的引物Tm 可能差异不小：GGGAA 和GAGAG 的Tm 是不一样的，所以确定引物Tm 最可信的方法是近邻分析法。这种方法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。;最佳的引物浓度一般在0.1 到0.5μM。较高的引物浓度会导致 非特异性产物扩增。 2. 最好用TE 溶解引物。TE 比去离子水好，因为水的pH 经常偏 酸，会引起寡核苷的水解。 ;Taq?DNA聚合酶分子量为94kD，Taq有很高的耐热稳定性。实验表明，在92.5℃、95℃、97.5℃时，其半衰期分别为40min、30min和5min。75℃时酶比活性为150bs/酶分子. ;Taq酶具有类似于末端转移酶的TdT的活性，可在 新生成的双链产物的3’端加上—个dATP碱基。 欲将PCR产物克隆到载体上，可以用两种处理办法： 一是构建dT-载体； 二是用Klenow酶将3’端的A去掉，即在PCR反应后， 先在99℃加热10min灭活Taq酶，加入Klenow片段， 室温下作用15-20min，3’端的A即被切去， ;4. dNTPs;Mg2+对PCR扩增的特异性（引物退火） 和产量（DNA聚合酶的活性）有显著的影响。 在多数情况下，