PCR课件 荧光PCR技术 知识及其应用.ppt

荧光PCR技术及其应用;目 录; PCR 反应原理; 多聚酶链式反应 （PCR：Polymerase Chain Reaction);体内DNA的复制体系;PCR反应循环; PCR的指数扩增（2n）;Taq;1）PCR反应成分;（2）引物浓度 0.1-0.5 ?mol/L 浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。 （3）Taq DNA聚合酶 0.5-2.5 U/50 ?l 酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。;（4）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。;（5） Mg2+;2）循环参数 变性 使双链DNA解链为单链 94℃， 20-30秒 (2) 退火 温度由引物长度和GC含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。 ;（3）延伸 70-75℃,一般为72℃ 延伸时间由扩增片段长度决定 （4）循环次数 主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加;PCR技术的特点;2）特异性;3）操作简便易行;RT-PCR与荧光定量PCR的区别;1. 反应原理不同 ＲＴ－ＰＣＲ;5’;原理：引入了C(t)值，C(t)值与起始模板浓度的对数成反比;RT-PCR反应步骤与产物定量 1) 按照如下体积向PCR管中按顺序加入各试剂 并混匀并离心： 10 X PCR反应缓冲液 2.5 μL 25mmol/L MgCl2 2.0μL 10mmol/L dNTP 1.0 μL Taq 0.1 μL(5U) 10μmol/L 引物1 1.0 μL 10μmol/L引物2 1.0μL 模板cDNA 1.0 μL 水补充至 25.0 μL;2) 反应完成后,将反应液与凝胶电泳缓冲液按比例混匀,上样电泳(1~1.5%琼脂糖凝胶)。;3) 利用电泳定量PCR产物;荧光PCR反应步骤与产物定量;2) 定量方法(绝对定量);3） 相对定量（引入看家基因，比较ct值）; 实时荧光定量PCR仪; 荧光PCR的试验设计;对照组：用作对照的样本，与实验组进行比较 实验组：未知样本，用于研究 目的基因(GOI)：用于研究的基因 内参基因(看家基因)：基因表达量比较恒定的基因，用于校正起始上样量的区别 参比样本(Calibrator): 用于比较的样本，如未处理样本、正常组织、0时相样本等 标准品(Standards)：梯度稀释的已知浓度的样品，测定未知样品的浓度和反应效率 Ct值： 样品扩增产物的荧光信号达到所设定的荧光阈值时需要的循环数 反应效率(E)：PCR扩增的速率;荧光PCR实验设计;1. 样本的准备(防止RNA 降解) ? 速度 ? RNA酶抑制剂 ? 保存条件(液氮速冻，－80℃保存) 2. RNA 提取步骤 ? 组织研磨后用Trizol裂解 加氯仿萃取分层 异丙醇沉淀RNA 75%乙醇洗沉淀 DEPC水溶解RNA 1％琼脂糖电泳检测RNA质量（两条带！）。;3. 逆转录： 试剂 ?逆转录引物 随机六核苷酸引物(总RNA) 或者OligodT 引物(mRNA) ?逆转录酶 AMLV, MMLV ? d NTP ? RNA 酶抑制剂 步骤 ? 核酸蛋白仪检测RNA浓度（5ul+95ul水），根据260/280检测RNA纯度，同时定量RNA。 ?取2ug RNA+OligodT 5ul+水至13ul体系，70℃ 5分钟后冰浴。 ?加入M-MLV(1ul), 5*M-MLV(5ul), d NTP(5ul), RNA 抑制剂 (1ul), 共12ul体系于反应管中，42