PCR手艺 原理及应用.doc

PCR最新技术 原理及应用。(polymerase chain reaction) 一：PCR的基本成分。 PCR包括7种成分：模板DNA , 特异性引物，热稳定DNA聚合酶，脱氧核苷三磷酸（dNTP）， 二价阳离子，缓冲液及一价阳离子。 （一）：模板DNA：待扩增的核酸序列。基因组DNA，质粒DNA，噬菌体DNA，预先扩增的DNA，cDNA和mRNA等几乎所有形式的DNA和RNA都能作为PCR反应的模板。 （二）：特异性引物：与靶DNA的3’端和5’端特异性结合的寡核苷酸片段，是决定PCR特异性的关键。只有当每条引物都能特异性与模板DNA中的靶序列复性形成稳定的结构，才能保证其特异性。引物越长，对于靶序列的特异性也越高。 引物特异性及优化设计 特性： 碱基组成 G+C含量应在40%~60%，4种碱基要分配均匀 长度 一般为18~25个核苷酸的长度，上下游引物长度差别不能大于3bp. 重复及自身互补序列 不能有大于3bp的反向重复序列或自身互补序列存在 上下游引物的互补性 一个引物的3’端序列不能结合到另一个引物的任何位点上。 解链温度（Tm） 两个引物的Tm值相差不能大于5摄氏度，扩增产物与引物的Tm值不能大于10摄氏度。 3’末端 尽可能使每个引物的3’末端碱基组成为G或C或，但不能为有NNCG或NNGC序列。 （三）热稳定性DNA聚合酶：是PCR技术实现自动化的关键 （四）脱氧核苷三磷酸：标准PCR反应体系中包括四种等摩尔浓度的脱氧核苷三磷酸，dATP，dTTP，dGTP，dCTP。在常规PCR反应液中，每种dNTP的浓度一般是在200~500umol/L之间。高浓度的dNTP（4mmol/L），对扩增反应有抑制作用。 （五）二价阳离子：所有的热稳定DNA聚合酶都要求有游离的二价阳离子。常用的是Mg 或Mn。由于dNTP和寡核苷酸都能结合Mg，因而反应体系中阳离子的浓度必须超过dNTP和引物来源的磷酸盐基团的摩尔浓度。 （六）缓冲液：维持PCR反应体系的PH，必须用Tris-HCL缓冲液。标准PCR缓冲液中的浓度为10mmol/L，在室温将PCR缓冲液的PH调至8.3~8.8之间。 （七）一价阳离子：标准的PCR缓冲液溶液中包含有50mmol/L的KCL，它对于扩增大于500bp长度的DNA片段是有益的，提高KCL浓度到70~100mmol/L，对于改善扩增较短的DNA片段也是有益的。 二：PCR的基本操作： PCR是一种级联反复循环的DNA合成反应过程。一个循环过程有三个步骤；（1）变性，通 过加热使模板DNA完全变性成为单链，同时引物自身和引物之间存在的局部双链也得以清 除；（2）退火，将温度下降至适宜的温度，使引物与模板DNA退火结合；（3）延伸，将温 度升高，热稳定DNA聚合酶以dNTP为底物催化合成新生DNA链延伸。 变性：双链DNA模板的变性温度由其G+C的含量决定，模板DNA的G+C的含量 越高，熔解温度也越高。变性的时间由模板DNA分子的长短决定。 在应用TaqDNA聚合酶进行PCR反应时，变性往往在94~95℃条件下进行。对于G+C 的含量=55%线性DNA模板，常规PCR的变性条件是94~95变性40s.当模板G+C 的含量55%时则需要更高的温度。 一步PCR 一步RT-PCR是指在同一管子中，利用同一种优化的反冲液， 在反转录酶和热稳定DNA聚合酶等的存在下，直接以RNA或mRNA为起始材料进行RT和PCR。一步PCR中，热稳定DNA聚合酶活性在整个过程反应过程中起决定性的作用。原理一：热稳定DNA聚合酶活性在反转录过程中被其抗体所抑制。在较低温度的RT反应中，热稳定DNA聚合酶没有活性；RT反应结束后，PCR过程中对模板变性所用的高温（94~95℃）使反转录酶失活，同时也使热稳定DNA聚合酶抑制物失活。原理二：一步RT-PCR中只有一种酶，且是热稳定DNA聚合酶（如TthDNA聚合酶）。 引物设计： 一步RT-PCR所用的引物为基因特异引物 反转录酶好和DNA聚合酶：使用缺乏RnaseH活性以及活性较低（AMV和M-MLV突变体，Super ScriptII，Strata Script反转录酶）；TthDNA聚合酶，既有DNA聚合酶活性，又反转录酶活性，但它合成的cDNA长度较短，保真度相对较低。所使用的热稳定DNA聚合酶（TITANIUM Taq，Platinum Taq，Taq-Plus Precision DNA聚合酶）。 常规RT-PCR和一步PCR的应用： 常规RT-PCR的技术应用： 制备用于杂交的cDNA