PI染色法测细胞周期课件.pptVIP

PI染色法测细胞周期 正常人静止体细胞有46条染色体，相当于7.10-12 pg DNA/细胞核，我们称之为二倍体细胞，而正常增殖细胞则存在不同的DNA含量。在细胞周期(G0，G1，S，G2 ，M)的各个时期，DNA含量随各时相呈现出周期性的变化：在G1期，细胞开始RNA和蛋白质的合成，但DNA含量仍保持二倍体； 进入S期后，DNA开始合成，这时细胞核内DNA的含量介于G1和G2期之间；当DNA复制结束成为4倍体时，细胞进入G2期，G2期细胞继续合成RNA及蛋白质，直到进入M期，因此，单纯从DNA含量无法区分G2期和M期；一旦有丝分裂发生，细胞分裂成两个子细胞，这两个子细胞或者进入下一个细胞周期，或者进入静止期(G0期)，而G0期从DNA含量上同样无法与G1期区分。因此，整个复制周期可以描述为G0/G1，S，G2/M期。 通过核酸染料标记DNA，并由流式细胞仪进行分析，可以得到细胞各个时期的分布状态，计算出G0/G1，S及G2/M的百分含量，了解细胞的增殖能力；结合DNA指数分析，还可进行凋亡、异倍体等检测。 Normal Cell Cycle 染料的选择取决于流式激光的配置。488nm的激光下应用PI(碘化丙啶)，由于PI也与RNA结合，所以分析前样本应用Rnase处理.。重要的是染料要足够，以保证饱和结合。PI的推荐浓度是至少20ug/106 个细胞。其最佳浓度为50ug/106 个细胞。 细胞浓度及质量要求 单细胞和核的上机浓度应约106/ml。浓度太低，上机时样本的流速不得不提高，这样就会影响检测的CV。浓度太高，则可能导致染料的相对不足，最终使染色不饱和，同样影响CV和检测结果。 制备完成后的标本应用光学显微镜检查其质量：细胞是否聚集或过多的碎片。 操作步骤 取一瓶生长期的A549细胞，倒掉瓶中旧的培养液，加入3mlPBS，细胞生长面在下轻轻晃动细胞瓶，然后去掉液体，加入1ml胰蛋白酶消化1~5分钟（以镜下观察决定） 加入5mlPBS轻轻吹打细胞生长面，制成细胞悬液，将细胞悬液移至15ml离心管中1500rpm离心5min，去上清。 加入500ulPBS轻轻吹打细胞团成细胞悬液，在旋涡状态下逐滴加入2ml-20℃95%冷乙醇，混匀后固定30min。 加入5mlPBS，1500rpm离心5min，去上清液。 加入5mlPBS重悬细胞，1500rpm离心5min，去上清液。 加入800ulPI染液，用枪轻轻吹打细胞团，混匀，室温避光染色30min 上机检测。 影响荧光染色的因素 温度：温度高于20℃时，即出现温度淬灭。 2、PH：PI在7.2~7.6，保持荧光染料分子与溶剂间的电离平衡。 3、荧光染料浓度：染料太少，结合不完全。染料过多，又会出现浓度淬灭现象。 4、固定剂：醛类固定剂会干扰插入性染料与核酸分子的结合，造成荧光发射强度减弱。 什么是流式细胞仪 流式细胞仪(Flow Cytometer 简称FCM)是一项集激光技术﹑电子物理技术﹑光电测量技术﹑计算机技术以及细胞荧光化学技术﹑单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。 什么是流式细胞术 简单说就是自动化的萤光显微镜 测定分析悬浮于液流中的颗粒在通过激光束时发出的光学信号的一个系统 流式细胞仪特点及检测标本 特异性强，灵敏度高，速度快，并能实现多参数分析； 可检测的样本种类多样 (1)外周血，骨髓，细针穿刺，洗脱液，实体组织，培养细胞 (2)血清、血浆、培养上清、细胞裂解液 流式细胞仪的结构 液流系统 将细胞引导至检测点 光学系统 产生并收集光学信号 电子系统 将光信号转换成电信号，使之数字化，输入计算机并分析 分选系统 液流系统 流动室 鞘液 酸碱平衡的电解液，可选PBS、血球稀释液或蒸馏水。 样本流 单细胞悬液，浓度5?105?1 ?106/mL 液流系统 -FLOW CELL(流动室)：是仪器的核心部件，被测样品在此与激光相交。 光学系统 光学激发系统 激光 激光 (Laser, light amplification by stimulated emission of radiation)是一种相 干光源，它能提供单一波长、高强度及稳定性高的 光照 488nm，635nm 光学信号 光学收集系统 光学滤片 透镜 光学信号 光学信号有两种 1.散射光信号：①前向角散射光 (FSC,Forward Scatter) ②侧向角散射光 (SSC,Side Scatter) 2.荧光信