突破__MTT法总结及结果分析.docVIP

基因是能表达而形成有功能产物（蛋白质或RNA）的DNA序列（或RNA） 基因不仅包括编码蛋白质肽链或RNA的核酸序列，还包括保证转录所必需的调控序列及位于编码区5 ’’端上游的非编码序列、内含子和位于编码区下游3 ’’端的非编码序列 基因分为三类：既转录，又翻译：编码蛋白质基因只转录，不翻译：ttRNA、rRNA不转录，不翻译：调控基因、假基因等 Denaturation(变性)：本质是双链间氢键的断裂 方法：加热、化学试剂 现象：OD260增高【增色效应】 解离曲线：OD260/T Tm：OD260达到最大值的一半时的温度称为DNA的解链温度。Tm与G+C%成正比，一般G+C%每增加1%，Tm增加0..4℃。如G+C% 占40%，则Tm为87 ℃，60%则升高至96 ℃。 Renaturation（复性）：变性的DNA在适当条件下，两条互补链可重新恢复天然的双螺旋构象，称为DNA复性。 Annealliing（热变性）::热变性的DNA经缓慢冷却后复性。退火越慢、温度越高，特异性就越好，否则错配的可能性就越大。 影响因素:DNA的序列、DNA浓度、DNA片段大小、温度【Tm–25 ℃】、溶液的离子浓度。 Hybridization（杂交）：DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以形成局部双螺旋 DNA Replication（复制）：半保留复制；双向复制；半连续复制 条件：模板 dNTP（N=AGCT） DNA聚合酶 引物 DNA突变：突变是某些疾病的发病基础；突变主要有错配、缺失、插入和重排；突变修复包括光修复、切除修复、重组修复和SOS修复。 基因表达：将DNA中储存的遗传信息转变为各种有功能的蛋白质（或RNA）的过程 基因的有关实验操作 1、核酸的分离、纯化 破碎细胞【超声波、EDTA、SDS处理】；用蛋白变性剂或蛋白酶去除蛋白质【酚:氯仿:异戊醇抽提】【蛋白酶】；用乙醇【异丙醇】沉淀核酸；用RNase去除残留RNA。 2、核酸的定量和纯度判断 分光光度法【紫外】：核酸分子在260nm处有特异的紫外吸收峰，吸收强度与核酸浓度成正比；在波长260nm的紫外线下，1个OD..的光密度相当于双链DNA浓度为50ug/ull，单链DNA或RNA浓度为40ug/ull，寡核苷酸浓度为33ug/ull。 3、核酸的贮存 DNA的贮存：将DNA溶于TE溶液中，贮存于4℃或-70℃。【EDTA可以鳌合金属二价离子，抑制DNA酶的活性，TE的PH值为8，可减少DNA的脱氨反应，-70℃可以保存5年】 RNA的贮存：将RNA溶于0..3 MNaAc(PH::5..2)或双蒸灭菌水中，贮存于-70℃。RNA长期保存可以沉淀形式贮存于乙醇中，-20℃保存，非常安全。 4.核酸的电泳分离-琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳的分辨率取决于凝胶的浓度，浓度越高，分辨率越高；反之，则越低；不同构型的DNA分子，其电泳迁移率也不同：构象越紧密，迁移越快；线性DNA分子迁移率的大小与其分子量大小的对数成反比，可以通过与Marker的较 来确定其分子量。 5、核酸分子杂交 核酸分子杂交的基本原理：是用已知的DNA或RNA片段（探针）来检测样品中未知 的核酸序列，通过核苷酸间的碱基互补原则相互结合，经显影或显色的方法，将结合的核苷酸序列的位置和大小显示出来。 探针（Probe）：能与特定核苷酸序列发生互补结合的带有标记物的已知的核酸片段。 探针的种类：基因组DNA(包括人、动物、细菌、病毒等）探针：来源于基因组文库。克隆于载体中取之不尽，相对稳定。cDNA探针：不含内含子和重复序列。RNA探针：与DNA结合牢固，因不存在互补链而使杂交效率更高，可以用RNase处理而降低成本，但不稳定。寡核苷酸探针：15-30bp的寡核苷酸，易于人工合成和修 饰，但所带标记物少。探针上必须带有可识别的信号标记，以便跟踪观察与其同源的核酸序列间的杂交反应的位置、大小及杂交信号的强弱。 探针的标记： 放射性标记物：灵敏度高、不影响酶的活性和碱基配对，缺点是易造成放射性污染。32P 35S 3H 14C 125II 131II 非放射性标记物：无放射污染。 生物素：核酸+生物素+亲和素+荧光蛋白【或酶】；地高辛：核酸+地高辛+抗地高辛蛋白+荧光蛋白【或酶】；荧光素：适用于细胞原位杂交和染色体杂交。 探针标记的方法：缺口平移标记DNA（Nick Translation）； 杂交的种类：Soutthern 印迹法（Southern blotting）基因组DNA限制性酶切 → 凝胶电泳【变性】→转化NC膜→ 杂交【探针】→ 结果检测【放射自显影】。 North