hoxc13基因在绒山羊皮肤中的表达规律及体外功能研究-expression and function of hoxc 13 gene in cashmere goat skin in vitro.docx

目录1引言11.1哺乳动物皮肤及被毛进化11.1.1脊椎动物皮肤及附属物的形态11.1.2脊椎动物皮肤附属物的蛋白组成11.1.3脊椎动物皮肤附属物的调控及重塑21.1.4脊椎动物皮肤及附属物的进化21.1.5哺乳动物被毛起源进化的假说31.2毛囊及皮肤的结构组成41.2.1构成毛囊的重要细胞41.2.2毛发各结构的功能划分51.2.3皮肤结构71.3毛囊形态发生及周期性生长81.3.1毛囊形态发生81.3.2毛囊生长周期91.4参与毛囊调控的信号分子10BMP 信号分子 11β连环蛋白（β-catenin） 12成纤维生长因子（Fibroblast growth factor, FGF） 12转化生长因子（Transforming growth factor, TGF) 141.4.5甾体激素受体超家族151.4.6无毛基因（Hairless, Hr） 171.4.7多肽类激素：甲状旁腺激素相关多肽，IGF-1 和催乳素 181.4.8同源异型框基因（Homobox，Hox） 201.5绒山羊绒毛发育的机理研究261.5.1绒山羊毛囊形态发生261.5.2绒山羊毛囊周期变化271.5.3绒山羊毛囊分子机理研究进展281.6毛囊发育相关基因的网络构建及系统生物学分析291.6.1转录网络的构建291.6.2皮肤毛囊转录网络的构建302本研究的整体框架312.1技术路线312.1.1Hoxc13 基因序列获取及进化分析 312.1.2绒山羊皮肤 Hoxc13 基因的表达研究 322.2拟解决问题332.3研究意义343绒山羊 Hoxc13 基因的克隆及 Hoxc13 在哺乳动物被毛进化中的作用 353.1材料353.1.1试验动物353.1.2仪器和试剂353.2试验方法363.2.1DNA 提取 363.2.2Hoxc13 序列的获取 363.2.3Hoxc13 序列分析 373.2.3长链 PCR 393.2.4克隆测序3PCR 产物纯化 3目的片段的连接40转化40重组质粒的鉴定403.2.5绒山羊 Hoxc13 基因结构分析 413.2.6绒山羊 Hoxc13 推定氨基酸的结构预测 413.3结果与分析413.3.1基因组 DNA 的提取与检测 413.3.2PCR 扩增结果 413.3.3重组质粒的鉴定42Kieser 法鉴定重组质粒 42PCR 鉴定重组质粒 433.3.4绒山羊 Hoxc13 基因序列分析 433.3.5绒山羊 Hoxc13 内含子结构分析 443.3.6绒山羊 Hoxc13 氨基酸序列分析及结构预测 453.3.5Hoxc13 基因的进化及氨基酸比对分析 4Hoxc13 基因在哺乳动物出现时发生了加速进化 4哺乳动物 Hoxc13 蛋白中存在一段富含甘氨酸的序列 4各动物 Hoxc13 蛋白的三级结构 513.4讨论534Hoxc13 在绒山羊皮肤中的表达特征 564.1材料564.1.1试验动物564.1.2仪器试剂564.1.3引物信息574.2试验方法574.2.1总 RNA 提取及纯化574.2.2cDNA 合成574.2.3基因克隆测序584.2.4实时定量 PCR 检测584.3结果与分析584.3.1总 RNA 提取584.3.2测序结果分析594.3.3Hoxc13 基因实时定量结果594.3.4Hoxc13 和毛囊活性变化规律相一致594.3.5Hoxc13 基因在胎儿时期的表达量与皮肤厚度变化趋势相一致614.4讨论615绒山羊皮肤成纤维细胞过表达 Hoxc13 对其他 HFDRGs 的影响635.1真核过表达载体 pECFP-Hoxc13 的构建635.1.1材料6主要仪器设备6试剂耗材6组织材料645.1.2方法6 绒山羊皮肤总 RNA 提取6cDNA 第一条链的合成6内蒙古白绒山羊 Hoxc13 基因 CDS 区序列克隆6过表达载体 pECFP-Hoxc13 的构建655.1.3结果66Hoxc13 基因 CDS 区序列获得66过表达载体 pECFP-Hoxc13 的构建665.1.4讨论675.2绒山羊皮肤成纤维细胞和皮肤角质化细胞的分离与体外培养675.2.1材料6主要仪器设备6活体材料6试剂及耗材6溶液配方695.2.2方法6绒山羊皮肤成纤维细胞的分离与体外培养6绒山羊皮肤角质化细胞的分离与体外培养70绒山羊皮肤细胞生长曲线的测定70绒山羊皮肤成纤维细胞中期染色体数目分析70绒山羊皮肤成纤维细胞对 G418 耐受性的检测 715.2.3结果7组织块贴附法分离培养绒山羊皮肤成纤维细胞7组织块贴附法分离培养绒山羊皮肤角质化细胞7皮肤细胞生长曲线的测定7细胞的染色体数目分析7绒山羊皮肤成纤维细胞对 G418 的耐受性检测735.2.4讨论735.3绒山羊皮肤成纤维细胞过表