hpv18 e2蛋白与hdaxx在细胞内的共定位及对凋亡的影响-co - localization of hpv 18e2 protein and hdaxx in cells and its influence on apoptosis.docx

mAbmonoantibody单克隆抗体ODopticaldensity光密度PBSphosophatebufferedsaline磷酸盐缓冲液PCRpolymerasechainreaction聚合酶链反应PMAphogrbol12-myristate13-acetate佛波酯rpmrevolutionsperminute每分钟转数RPMI-1640roswellparkmemorialinstitute1640mediumRPMI-1640培养基SDSsodiumdodecylsulphate十二烷基磺酸钠SDSSDS-polyacrylamidegelelectrophoresisSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳TBSTris-bufferedsalineTris缓冲盐溶液TBSTTween20/Tris-bufferedsaline吐温20/Tris缓冲盐溶液TETris/EDTAbufferTris/EDTA缓冲液TEMEDN,N,N′,N′-tetramethylethylenediamineN,N,N′,N′-四甲基乙胺TNF-αtumornecrosisfacter-α肿瘤坏死因子αTrisTris-(hydroxymethyl)aminomethane三羟甲基氨基甲烷HPV18E2蛋白与hDaxx在细胞内的共定位及对凋亡的影响硕士研究生：张琴导师：万艳平教授中文摘要目的：分析人乳头瘤病毒18型（HPV18）E2蛋白与hDaxx在细胞内的分布与共定位，并初步研究两种蛋白质对凋亡的影响，为进一步探索E2蛋白在HPV18致癌机制中的作用以及E2防治性疫苗的研制提供实验依据。方法：（1）将质粒pEGFP-C1/E2和pDsRed-Monomer-C1分别用EcoRI与BamHⅠ双酶切，前者回收小片段约1000bp酶切产物，后者回收酶切产物，T4连接酶连接后，转化E.coliJM109，筛选阳性克隆，构建Red-HPV18E2融合蛋白表达载体pDsRed-Monomer-C1/E2。（2）将质粒pDsRed-Monomer-C1/E2转染HeLa细胞，利用倒置荧光显微镜观察HPV18E2蛋白在真核细胞中的表达与定位，并通过Western-blot进一步检测其表达。（3）将质粒pDsRed-Monomer-C1/E2与pEGFP-C1/hDaxx共同转染HeLa细胞，利用激光共聚焦显微镜观察HPV18E2蛋白与hDaxx的分布，并分析它们的共定位。（4）将0.5μg与1.0μgpcDNA3.1(-)/hDaxx质粒分别和2.0μgpcDNA3.1(-)/E2质粒瞬时共转染HeLa细胞，设pcDNA3.1(-)转染组和空细胞组作为对照。48h后，分别收集各组细胞，经75%乙醇4℃固定过夜，PI染色后，用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。（5）将0.5μg与1.0μgpcDNA3.1(-)/hDaxx质粒分别和2.0μgpcDNA3.1(-)/E2质粒瞬时共转染HeLa细胞，设pcDNA3.1(-)转染组和空细胞组作为对照，培养48h后，分别收集各组细胞，按Caspase-8试剂盒说明书操作，用酶标仪测定405nm波长下的吸光度(A值)，计算Caspase-8的相对活性。结果：（1）重组质粒经双酶切鉴定，得到目的小片段约1100bp，测序分析所克隆的目的片段与GenBank上公布的HPV18E2（NC_001562）基因序列一致，即构建了pDsRed-Monomer-C1/E2重组体。（2）真核表达载体pDsRed-Monomer-C1/E2能在HeLa细胞内表达DsRed-HPV18E2融合蛋白，且主要分布于细胞浆与细胞核。（3）质粒pEGFP-C1/hDaxx转染的细胞，hDaxx定位细胞核；质粒pEGFP-C1/hDaxx和pDsRed-Monomer-C1/E2共转染细胞，hDaxx在细胞浆与细胞核均有，且绿色与红色荧光重叠为黄色荧光，即HPV18E2蛋白与hDaxx发生共定位。（4）2μgpcDNA3.1(-)/E2+1.0μgpcDNA3.1(-)/hDaxx组凋亡率明显高于2μgpcDNA3.1(-)/E2+0.5μgpcDNA3.1(-)/hDaxx组，差异具有显著性（P＜0.001）；且两组凋亡率都显著高于其他组，差异具有显著性（P＜0.001）。pcDNA3.1(-)/E2组凋亡率明显高于pcDNA3.1(-)组及空细胞组，差异具有显著性（P＜0.001）。（5）2μgpcDNA3.1(-)/E2+1.0μgpcDNA3.1(-)/hDaxx组Caspase-8的相对活性高于2μgpcDNA3.1(-)/E2+0.5μgpcDNA3.1(-)/hDaxx组，差异有统计学意义（P＜0.01）；且两组凋亡率都显著高于其