hsp90抑制剂17aag对htlv1感染hut细胞株jak3stat5信号通路的影响-effects of hsp 90 inhibitor 17aag on the signal pathway of htl v1 infected hut cell strain jak 3 stat 5.docx

否存在一定的联系，是怎样的联系，以此希望进一步加深对 ATL 发病机制的理解，为 ATL 的靶向治疗研究提供更多的理论依据。研究内容与方法：1、细胞培养，使用 RP-1640+10%胎牛血清配成完全培养基培养 HUT-102细胞，并定期传代、换液。2、WESTERN-BLOT 方法：2.1 检测 HUT-102 细胞、JURKAT 细胞以及外周血单个核细胞（PBMC）内 JAK3 蛋白、STAT5 蛋白、P-STAT5 蛋白、HSP90 表达。观察各组细胞间蛋白 表达量的不同。2.2 稀释不同浓度 HSP90 特异性抑制剂 17-AAG (0-2000NM) 作用于 HUT-102 细胞 24、48 小时，分别提取各组细胞总蛋白，WESTERN-BLOT 检 测各组 JAK3 蛋白、STAT5 蛋白以及 P-STAT5 蛋白表达的变化趋势。2.3 使用 1000NM 浓度 17AAG 作用于 HUT-102 细胞 0、3、6、9、12、24 小时后提取细胞总蛋白，WESTERN-BLOT 检测各组 JAK3 蛋白、STAT5 蛋白 以及 P-STAT5 蛋白表达的变化趋势。2.4 分别设入无刺激组、17AAG+CP690550 组、17-AAG 组、CP690550组分别刺激 HUT-102 细胞 24h，提取处理细胞总蛋白 WESTERN-BLOT 检测JAK3 蛋白表达情况3、RT-PCR将不同浓度（0、125、250、500、1000NM）抑制剂刺激 HUT-102 细胞 24h 后，提取细胞总 RNA，使用 RT-PCR 方法检测各组细胞 JAK3mRNA 的表 达情况，GAPDH 为设定内参。4、CCK8稀释不同浓度 17AAG(0、500、1000、2000、4000、5000、8000NM)作用于 HUT-102 细胞，分别于 12、24、48、72 小时后 CCK8 法检测细胞吸光度值， 计算细胞存活率。5、AnnexinV-PI稀释 17AAG 浓度至 0、250、500、1000、2000NM 分别作用于 HUT-102细胞，48 小时后 AnnexinV-PI 法结合流式细胞仪检测分析细胞凋亡率。6、免疫共沉淀（CO-IP）将 JAK3 抗体、磁珠与 HUT-102 细胞总蛋白内 JAK3 蛋白相结合，将磁珠- 蛋白-抗体复合物沉淀后去除磁珠跟抗体，WESTERN-BLOT 检测沉淀蛋白内是 否含有 HSP90 蛋白。结果1、HSP90 蛋白在正常人 PBMC 以及细胞株 HUT-102、JURKAT 中均有表 达。但正常人 HSP90 蛋白表达量显著低于两种 T 淋巴肿瘤细胞株，JAK3/STAT5 蛋白几乎不表达。与 JURKAT 细胞相比，HUT-102 细胞内 HSP90、JAK3、STAT5 以及 P-STAT5 蛋白表达量显著增高。2、CCK8 结果显示,随着 17AAG 浓度的增加以及孵育时间的增长，细胞存 活率逐渐下降。其中 17AAG 浓度在 0-2000NM 之间时下降最明显，在浓度达到 2000NM 以后细胞存活率达到最低值并趋于平稳。从时间上分析结果显示，随着 孵育时间的延长，17AAG 对细胞的抑制作用逐渐加大，至 48h 时细胞抑制率达 到最大，而后到 72h 时，与 48h 相比结果无明显差异（P0.05）3、使用流式细胞仪分析细胞凋亡。Annexin V-FITC（+）PI（-）为早期凋 亡细胞，Annexin V-FITC(+)PI(+)为晚期凋亡细胞。结果显示使用 17-AAG 后肿 瘤细胞 HUT-102 的早期凋亡细胞所占比例增加。着 17-AAG 浓度的上升， HUT-102 细胞凋亡率逐渐增加。4、与未刺激组相比，刺激组 JAK3 与 P-STAT5 蛋白表达明显下降（P0.05）。 随着抑制剂浓度的增加，这种抑制强度随之增加。各浓度（125-2000NM）抑制 剂作用细胞 48h 时，P-STAT5 蛋白几乎检测不出。同样条件下，检测总 STAT5 蛋白发现，各刺激组与非刺激组总 STAT5 蛋白表达之间无显著差异（P0.05）。5、同一浓度水平下，随着抑制剂作用时间增长，JAK3 蛋白表达水平逐渐 降低，至 24h 时几乎检测不出。而 P-STAT5 蛋白水平在 1000NM 浓度的 17-AAG 作用≥4h 后均检测不出。但 HUT-102 细胞总 STAT5 蛋白表达水平并未随抑制 剂作用时间的变化而有所增减（P＞0.05）。6、使用 RT-PCR 方法检测不同浓刺激下细胞 JAK3mRNA 表达情况。各刺 激组细胞 JAK3mRNA 并 未 随 着 抑 制 剂 17-AAG 浓 度 的 增 加 而 明 显 变 化 ，（P0.05）。7 、根据 CO