il1β和ifnγ介导胰岛ins1e细胞凋亡的机制-mechanism of il 1β and ifn γ mediating islet ins1e cell apoptosis.docx

摘要目的：研究炎性因子IL-1β、IFNγ联合介导胰岛β细胞系INS-1E细胞产生凋亡的机制。方法：1、收集临床Ⅱ型糖尿病人和正常人的血清并记录基本资料，用ELISA试剂盒分别检测糖尿病组和正常组血清中IL-1β和IFNγ的含量并进行组间比较；2、将INS-1E细胞分为对照组和凋亡组，对照组用正常培养基培养48小时，凋亡组用浓度为100U/mlIL-1β、1000U/mlIFNγ的炎性因子培养基刺激48小时。MTS检测两组细胞的活力并进行组间比较；光学显微镜观察两组细胞形态的变化；houchest33253对两组细胞的细胞核进行染色并用荧光显微镜观察两组细胞细胞核的变化；免疫荧光染色法对两组细胞中Bax以及线粒体进行标识，并用荧光显微镜观察Bax在细胞中与线粒体位置关系的变化；Westernblot检测两组细胞中蛋白质磷酸化水平、蛋白表达量的变化并进行组间比较；将无意义质粒、TCTP过表达质粒、shRNA阻断质粒分别包被在腺病毒中侵染INS-1E细胞，侵染48小时后得到空载体组、TCTP过表达组、TCTP阻断组三组细胞，用荧光显微镜观察自带绿色荧光的质粒在三组细胞中的表达效率；Westernblot检测三组细胞蛋白中TCTP表达量的变化；用浓度为100U/mlIL-1β、1000U/mlIFNγ的炎性因子培养基分别作用于三组细胞，作用时间为48小时，MTS检测三组细胞的活力，用TCTP过表达组和TCTP阻断组的细胞活力分别与空载体组的细胞活力进行比较。结果：1、ELISA检测糖尿病组与正常组血清的IL-1β与IFNγ的含量：结果显示糖尿病组血清中IFNγ的浓度为0.29ng/L，与正常组（0.08ng/L）之间的差异有显著性意义（P0.01）；糖尿病组IL-1β的浓度为0.38ng/L，与正常组（0.12ng/L）之间的差异也有显著性意义（P0.01）。2、MTS检测结果证实凋亡组细胞活力（0.28）与对照组（0.68）之间差异有显著性意义（P0.01）；3、光镜下凋亡组细胞形态发生皱缩而对照组细胞形态良好；荧光显微镜下IIhouchest33258标识的凋亡组INS-1E细胞核出现核浓缩、核碎裂等典型的凋亡形态改变，而对照组细胞核形态正常；对照组线粒体和Bax都均散在分布于细胞质中，而凋亡组中线粒体出现聚集同时Bax向线粒体迁移并与线粒体形成共定位；4、Westernblot检测凋亡组的细胞蛋白并与对照组进行比较发现凋亡组中TCTP的表达量降低，P53和cleavedcaspase-3的表达量升高；凋亡组中Bcl-2家族内具有拮抗凋亡作用的Bcl-2、Bcl-xl和Mcl-1表达量降低；Bcl-2家族内具有促进凋亡作用的Bax和Bad蛋白表达量变化不明显；凋亡组中反映细胞增殖活力的激酶AKT活性降低；5、荧光显微镜下三组细胞内的绿色荧光质粒均大量表达；过表达组TCTP水平升高，阻断组TCTP水平降低；MTS检测结果显示TCTP过表达组的细胞活力（0.49）与空载体组（0.35）之间差异有显著性意义（P0.01），而TCTP阻断组（0.27）的细胞活力与空载体组（0.35）之间差异有显著性意义（P0.05）。结论：1、Ⅱ型糖尿病人血清中存在异常升高的IL-1β、IFNγ。2、IL-1β、IFNγ联合作用于胰岛INS-1E细胞可以使Bcl-2家族中抗凋亡成员的表达降低同时促进Bax向线粒体迁移引起内源性凋亡。关键词：IL-1β、IFNγ、INS-1E、细胞凋亡IIIABSTRACTObjective:ApoptosismechanismresearchofINS-1Ecellmediatedbyinflammatorycytokines(IL-1βplusIFNγ)Methods:ThecontentofIL-1βandIFNγweremeasuredintheserumfrombothdiabeticpatientsandmatchedhealthygroup;INS-1EcellviabilityandmorphologywereevaluatedbyMTTandmicroscoperespectivelyafterIL-1βplusIFNγtreatment;Proteinphosphorylation,expressionanddistributionwereexploredbywesternandimmunostainingbeforeandafterexposuretoinflammatorycytokines.TCTPoverexpressionandknockdowninINS-1EcellswereachievedbyadenovirusinfectionandtherolesofTCTPininflammat