分子生物学-09-3-重组DNA技术知识内容 切 连.pptVIP

一、基因工程生产的药品 1.基因工程疫苗 乙肝，丙肝，爱滋病，流行性感冒，出血热，人乳头瘤病毒，巨细胞病毒等。 结核，麻风，霍乱，痢疾，肺炎等。 血吸虫，疟疾等。 各种肿瘤疫苗。 …… 粘粒是将质粒和λ噬菌体改建的一种人工载体。 cosmid只含有λ噬菌体的复制起点，抗性标记(来自质粒)以及cos粘性末端，多用于构建高等生物的基因文库。 粘粒(cosmid) 略讲 2. 粘粒(cosmid)的组成 2. 抗性基因； 1. 质粒复制的起始位点(ORI)； 3. 用于插入目的基因的单个酶切位点； 4. ?噬菌体的cos位点。 可见，cosmid是由质粒和?噬菌体的cos位点构建而成。 略讲 可环化，不会裂解宿主细胞 (λphage ) 可自我复制 (plasmid) 45 kb外源DNA 可与同源序列质粒重组 粘粒是将质粒和λ噬菌体改建的一种人工载体。 粘粒(cosmid)特点 pJB8 5.4 kb BamHⅠ ClaⅠ Hind Ⅲ cos Ori AmpR Sal Ⅰ 可插入长达27～41kb的外源基因，方便地用于克隆大片段DNA。 加入噬菌体头部和尾部蛋白，可将粘粒包装成类似于噬菌体的具感染能力的颗粒，方便地进入大肠杆菌。 粘粒进入细菌后则完全失去噬菌体的功能，而表现质粒的特性。 略讲 3. M13噬菌体 噬菌体 正链 复制 复制型 DNA 经pII蛋白 造缺口 3′ 5′ 经pII 蛋白 剪切 释出单链DNA(正链) 进入下 一循环 5′ 3′ 3′ 5′ 滚环复制 在细菌内的复制模式图 复习微生物 M13噬菌体几个重要特点： 1. M13噬菌体不溶解宿主细胞，只是降 低宿主细胞的生长速度。 2. M13噬菌体能以单链和双链两种方式存在，因此可以用感染(经包装的单链DNA)和转化(双链DNA)。 3. 克隆的外源基因片段不宜大于1000bp。 复习微生物 M13噬菌体用途： 1. DNA序列测定； 2. 制备单链DNA探针； 3. 用于定点突变的研究。 复习微生物 P1噬菌体 PAC BAC, 细菌人工染色体 YAC, 酵母人工染色体 着丝粒 端粒 自主复制元件，ARS 大片段DNA克隆载体 略讲 几类载体的比较 载体 插入片段大小 Plasmid 0~10 kb Insertion λ vector 0~10 kb Replacement λ vector 9~23 kb Cosmid 33~44 kb P1 phage 70~100 kb PAC 130~150 kb BAC 300 kb YAC 0.2~2.0 Mb 略讲 分 分离 分离目的基因 分离载体 切 切割 限制酶切割目的基因和载体 连 连接 将目的基因和载体拼接成重组体 转 转化 重组体转入受体细菌 筛 筛选 从受体菌中筛选出重组体（转化子） 重组DNA技术 基因重组步骤 基因工程的基本步骤 1.基因工程的上游技术：基因重组 + + 连接 转化、筛选和鉴定阳性克隆 含重组子的阳性克隆 载体 目的基因 分、切、接、转、筛 以下内容 详见 《基因工程》 2. 基因工程的下游技术（表达）： (1) 发酵工程 (2) 蛋白质的分离、纯化与质量鉴定 发酵条件(生物反应器结构、细菌培养温度、空气通量、pH及培养基成分等)的优化组合。 基因工程的基本步骤 重组DNA技术操作的主要步骤 重组DNA技术 目的基因 载体 质粒 噬菌体 病毒 基因组DNA cDNA PCR产物 限制酶消化 开环载体 目的基因 连接酶 重组体 转化或体外包装 或转染 带重组体的宿主 筛选 表型鉴定 酶切电泳鉴定 菌落原位杂交 一、 目的基因的制备—分 (一) 人工合成法(也即化学合成法) 本方法适用于分子量较小的目的基因 (100bp以内)。 缺点： 2. 如目的基因DNA序列需通过氨基酸序 列推测，难于保证与天然基因序列一 致，往往导致表达效率大大降低。 1. 只能合成较小片段的DNA(100bp以内)。 (二)反转录法 本法是应用得最多的获取目的基因的方法。但前提