分子生物学-10-5-蛋白质技术知识.pptVIP

蛋白质组学的研究方法和进展 分子生物学讲义 山西师范大学生命科学学院 5.5.1 双向电泳技术 背 景 基因数量有限性和基因结构的相对稳定性 从genomic到proteome vs 生命现象的复杂性和多变性 随着2001年2月15日人类全基因组序列草图的完成，也宣告人类将由基因组计划进入后基因组时代。 基因组时代的研究发现，在揭示基因组精细结构的同时，也显示出基因数量的有限性和基因结构的相对稳定性，这与生命现象的复杂性与多变性之间存在着巨大反差。这种反差的存在使人们认识到，要研究生命现象，仅仅研究基因组的结构是远远不够的，必须对生命活动的直接执行者一蛋白质的重要性有更深刻的了解，因此， 一个以“蛋白质组”为研究重点的时代已悄然到来。 proteome “蛋白质组”一词的英文是PROTEOME，由PROTEins和genOME两个词组合而成， 这一概念是由澳大利亚Macquarie大学的Wilkins和Williams在1994年提出的， 广义上讲，蛋白质组是指“一个细胞或一个组织的基因组所表达的全部蛋白质”。 作为研究蛋白质组的三大核心技术之一，（另外两种分别是计算机图像分析与大规模数据处理技术以及质谱技术）。 基因组与蛋白质组比较 1 同一性与多样性 2 有限与无限 3 静态与动态 4 时间与空间 5 孤立行为与相互作用 6 单一手段与多种技术 蛋白质组学主要研究内容 了解某种特定的细胞、组织或器官制造的蛋白质种类； 明确各种蛋白质分子是如何形成类似于电路的表达-互作网络的； 描绘蛋白质的精确三维结构，尤其是其结构上的关键部位，如与药物结合并且决定其活性的部位。 蛋白质组学的研究策略1/2 1、竭泽法涸泽而渔眉毛胡子一把抓 即采用高通量的蛋白质组研究技术分析生物体内尽可能多乃至接近所有的蛋白质，即蛋白质的表达模式(Expression Profile)，这种观点从大规模、系统性的角度看待蛋白质组学，也更符合蛋白质组学的本质。 2、功能法某特定生理功能的动态研究 旨在研究不同状态细胞蛋白质组成、定位和修饰等的变化，如蛋白质在不同环境下的差异表达、差异定位和差异修饰，以发现有差异的蛋白质种类或者形式作为主要目标。 蛋白质的动态变化研究，已经成为蛋白质组学研究的核心内容。 蛋白质组学的研究策略2/2 功能蛋白质组学 （核心内容）(functional proteomics) 功能蛋白质组：细胞在一定阶段或与某一生理现象相关的所有蛋白质。 它是介于对个别蛋白质的传统蛋白质化学研究和以全部蛋白质为研究对象的蛋白质组学之间。 研究的策略是： 从局部入手研究蛋白质组的各个功能亚群体。然后将多个亚群体组合起来，逐步描绘出接近于生命细胞的“全部蛋白质”的蛋白质组图谱 蛋白组学的技术支撑体系 第一类是蛋白质组的分离技术。如双向凝胶电泳技术，细胞分级分离技术、亲和层析技术等。 第二类是蛋白质组的鉴定技术，其核心是质谱技术。 质谱鉴定技术面临的一个最大问题是，它要依赖于已知的蛋白质或基因的序列作为检测的基础，通过比较来确定待测定的蛋白质。对于在已有数据库中没有记载的全新蛋白质进行鉴定则非常困难，对于这种蛋白质，一般是利用经典的Edman降解法进行N端序列测定或C端化学降解法测定C端序列，即 “从头测定”(De Novo Identification)从而得到未知蛋白质的信息。 关键技术包括样品分离技术、2D（双向电泳）技术、质谱鉴定技术、X-射线晶体衍射、核磁共振等技术等 生物学问题的提出 实验模型的设计 实验组和对照组样品的制备 蛋白样品的IEF和PAGE电泳分离 图像扫描和初步分析 感兴趣蛋白点的切取 胰酶对脱色后蛋白质的消化 质谱的多肽指纹图、微测序分析 质谱结果的生物信息学分析和比对 新蛋白质的发现 其它实验的进一步验证 蛋白信息的初步获得 蛋白质组研究的试验方案 蛋白质样品的制备 双向电泳 图像分析 转印至膜上的蛋白 凝胶中的蛋白 溶液中的蛋白 混合肽 蛋白质质量 N端测序 肽序列质谱数据 肽指纹图 数据搜索 新的或已知蛋白 蛋白转录后修饰的鉴定 蛋白质组研究的技术流程 2D = IEF/SDS年，O’Farrell等人根据不同组分之间的等电点差异和分子量差异为两种不同的分离原理，建立了IEF/SDS-聚丙烯酰胺凝胶双向电泳的分离技术，简称IEF/SDS。 O’Farrel的双向电泳技术是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离与展示的分离技术，一般能分离1000 – 3000个蛋白质点，最好的胶能分离得到11000个左右的蛋白质点 第一向等电聚焦 第一向进行等电聚焦（isoelectric focusing ,IEF）, 由于蛋白质具有两性解离和等电点特性，将蛋白质样品加载至