2010生化实验提交版.doc

2010-2011第一学期生物化学实验教学内容 实验内容与方法 实验一 小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定（一） 组织匀浆法制备过氧化氢酶粗提液 【学时】4学时 【分组】5人一组 【器材】 1、动物：成年小鼠 2、器材：手套、镊子，剪刀，肾盘，冰袋，电子天平，托盘天平，组织捣碎机，10mL匀浆管，冰浴盒，吸量管，滴管，50mL量筒，100mL烧杯，50mL锥形瓶，玻璃棒，离心管，离心机，制冰机，4℃冰箱，纱布，滤纸 3、试剂：0.05mol/L醋酸-乙醇（23.5％）缓冲液，pH4.0 ；氯仿 【方法】 颈椎脱臼法处死小鼠（6只），取肝脏，用滤纸吸净血液后每组称重 g； 加入肝重8.5倍体积的预冷匀浆缓冲液（0.05mol/L, pH4.0醋酸缓冲液,23.5％乙醇，），用组织捣碎机匀浆3-5min。 缓慢滴加肝重0.5倍体积的氯仿（边加边搅拌），再次匀浆1min； 匀浆液离心，40C 6000rpm , 30min后，弃沉淀，收获上清液。 【留样】取匀浆后上清液60uL，加入20 uL 4×电泳上样Buffer，沸水浴3-5分钟，备用于SDS检测，-20℃冰箱保存。另取60 uL匀浆后上清液-20℃冰箱保存，用于酶活的测定和蛋白定量。 实验二 小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定（二） 盐析与透析法初步纯化过氧化氢酶 【学时】8学时 【分组】5人一组 【器材】 1、100mL烧杯，冰浴盒，制冰机，JT-1型定时电磁搅拌器，离心管，托盘天平，离心机，透析袋（截留量10KD，直径2公分），滴管，50mL量筒，5mL吸量管，透析袋（截留量10KD，直径1公分） 2、试剂：0.5mol/LNa2SO4；0.1mol/L pH7.8磷酸缓冲液；透析液（20%乙醇，0.1mol/L pH4.7醋酸缓冲液，0.1mol/L NaCl）,50%甘油 【方法】 冰浴搅拌状态下，向肝匀浆上清液中缓慢滴加0.06倍体积的0.5M Na2SO4溶液，继续冰浴搅拌1h； 将盐析溶液离心（40C，6000rpm，10min）后弃去上清，保留沉淀； 用肝重4倍体积的的磷酸缓冲液（0.1mol/L，pH7.8）溶解沉淀（用手动玻璃匀浆器助溶）10min ，离心（40C 4000rpm , 10min）后，弃去沉淀，保留上清液； 【留样】取盐析后上清样品60ul，用20 uL 4×电泳上样Buffer制样，备用于SDS检测。-20℃冰箱保存。 将透析袋（截留量10-20KD，直径2公分）置于沸水中煮5min，清洗晾凉后备用； 将上清液放入透析袋（截留量10-20KD，直径2公分）内，置于透析液（20%乙醇，0.1mol/L pH4.7醋酸缓冲液，0.1mol/L NaCl溶液）中透析一周，中途更换一次透析液； 一周后，取出透析袋内混浊溶液， 离心（40C，6000rpm，10min）后，弃去上清，收集沉淀； 用2mL~3mL的磷酸缓冲液（0.1mol/L，pH7.8）溶解沉淀15min（用手动玻璃匀浆器助溶）， 离心（40C，4000rpm，10min）后，弃去沉淀，收获上清液。（测OD280。若蛋白浓度小于1mg/ml，则二或三组上清液合并后方可做下面的试验） 【留样】取透析后上清样品60ul，用20 uL 4×电泳上样Buffer制样，备用于SDS检测。放置-20℃冰箱保存。 将透析袋（截留量10KD，直径1公分）置于沸水中煮15min，清洗晾凉后备用； 将收获的样品液放入处理后的透析袋（截留量10KD，直径1公分）中，置于50%的甘油中包埋浓缩2小时，待样品浓缩至400~500ul收样，放置4℃冰箱保存。 实验三 小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定（三） 凝胶层析法进一步纯化纯化过氧化氢酶 【学时】4学时 【分组】5人一组 【器材】 1、玻璃层析柱（直径1.8cm长45cm）、细乳胶管、夹子、玻璃棉或棉花、细玻璃棒、收集管（试管）、试管架、紫外\可见分光光度计（型号-9100）、锥形瓶、吸量管 、滴管。 2、试剂： sephadexG-200，0.1mol/L pH7.8磷酸盐缓冲液 【方法】 凝胶的处理取葡聚糖凝胶干粉，浸泡于蒸馏水中充分溶胀，倾斜法除去表面悬浮的小颗粒，等体积磷酸缓冲液继续浸泡。 装柱将层析柱下端的止水紧，向柱中加入约 5-7cm 高的缓冲液，开启止水最后放入略小于层析柱内径的滤纸片，以防加样时凝胶被冲起。 OD407nm和OD280 nm重叠峰值管，再次测定OD407nm和OD280 nm波长下的吸收值即为最终纯化得到的产物。 【留样】取2mL纯化产物存样，备用于蛋白浓度及Km值测定，放置4℃冰箱保存。 10、【留样】 取浓缩后的层析纯化样品60uL，用20 uL 4×电泳上样Buffer制样，备用于SDS检测，放置-20℃冰箱保存。