利用体细胞核移植技术生产转hgfap-dsred基因巴马小型猪的初步研究-preliminary study on the production of bama miniature pig transformed with h gfap - ds red gene by somatic cell nuclear transfer technology.docxVIP

霉素筛选获得了肾脏、睾丸和耳部细胞转基因克隆斑，PCR鉴定结果与目的 片段大小一致，所获得的克隆斑为转基因体细胞。检测了转基因细胞是否 被微生物(细菌、真菌、病毒)污染，三种转基因细胞的培养液均未见浑 浊现象，结果表明，转基因肾脏、睾丸和耳朵成纤维细胞均未被细菌和真 菌污染；用红细胞吸附实验检测转基因细胞系是否被病毒污染，结果未见 细胞凝聚成团或者与体细胞吸附，表明3种不同组织来源的转基因成纤维 细胞未被病毒污染；采用PCR和Hoechst33342染色检测支原体污染，结果 为阴性；分析不同代次转基因细胞的核型，结果表明，随着代次的增大正 常2倍体细胞的比率有降低的趋势，但差异不显著；对转基因细胞系进行 了长期的传代培养，转基因肾脏成纤维细胞目前己传至56代，转基因耳部 成纤维细胞传至30代，转基因睾丸成纤维细胞传至25代。总之，本试验 成功建立了3种类型转基因细胞系，为后续的体细胞核移植实验提供了高 质量，充足的转基因供体细胞。3．转基因克隆胚胎融合／激活条件的优化 融合／激活是体细胞核移植重构胚胎构建关键的一步，只有经过融合、激活的胚胎才能开始重编程，启动基因表达，继续发育。本实验优化了转 基因克隆胚胎融合／激活的参数，结果如下：脉冲时程30肛s，1次脉冲，场 强1．5kv／cm组，融合率(87．32％)和分裂率(69．79％)显著高于 1．OKV／cm(78．63％，45．07％)和2．Okv／cm(63．87％，36．72％)。囊胚率显著高 于1．Okv／cm和2．Okv／cm(21．74％vs．9．65％，5．49％，PO．05)；脉冲时程 30ps时，融合率(81．92％)和囊胚率(19．56％)显著高于20肛s(69．19％，7．51％)和40肚s(69．28％，6．51％)，(PO．05)；3次脉冲组的融合率(63．32％vs．IT万方数据81．92％，81．59％，PO．05)、分裂率(38．09％VS．63．40％，67．46％，PO．05) 和囊胚率(5．49％VS．33．15％，12．97％，PO．05)均显著低于1次脉冲和2 次脉冲组；而在相同脉冲次数和脉冲时间下，转基因克隆胚胎需要的场强 相对要大。总之，本实验室条件下，最适合于转基因克隆猪胚胎生产的融 合／激活参数是1．5kv／am、301上s和1次脉冲。4．供体细胞的细胞周期、细胞种类和细胞代次对转基因克隆胚发育的影响供体细胞所处的细胞周期，细胞种类和细胞代次对体细胞核移植胚胎 的发育潜能有很大的影响，本实验检测了血清饥饿、Roscovit ine和接触抑 制法对转基因细胞同期化效果以及三个处理组细胞作为供体核对重构胚胎 发育能力的影响；比较了不同类型的转基因供体细胞作为供体核对构建重 构胚胎发育潜能的影响；采用第lO、20、30代的转基因肾脏成纤维细胞作 为供体核，研究细胞的代次对转基因克隆胚胎发育潜能的影响。研究结果 如下：三种同期化方法均能将80％以上的细胞处于GO／G1期，接触抑制和 roscovitine组显著高于血清饥饿组(92．1l％，89．59％vs．80．82％，PO．05)； 相反，处于S期的细胞，血清饥饿组显著高于接触抑制组和roscovitine (14．99％vs．2．54％，6．34％，PO．05)；处于G2／M期的细胞，三组之间差异 不显著(PO．05)；血清饥饿组、接触抑制组和roscovitine处理组，细胞 凋亡率分别为(14．13％，6．71％，2．46％)，血清饥饿组细胞凋亡率显著高于 另外两组(P0．05)。检测了三个处理组的细胞BAX，BCL一2的相对表达量， BAX的表达量以血清饥饿组最高，而血清饥饿组BCL一2表达量最低。结果表 明：血清饥饿能够增加转基因细胞的凋亡率，roscovitine能够降低转基因¨T万方数据细胞的凋亡率；以三种细胞为供体核所获得囊胚率，血清饥饿组显著低于 roscovitine组和接触抑制组(14．2％vs．21．30％，20．3％，PO．05)。转基因。肾脏成纤维细胞、耳部成纤维细胞和睾丸成纤维作为供体核构建的克隆胚 胎囊胚发育率差异不显著(18．08％，10．19％， 10．76％，PO．05)。结果表 明：三种类型的转基因细胞均支持克隆胚胎的发育，以肾脏成纤维细胞为 供体时囊胚率最高，肾脏成纤维细胞更适合于转基因克隆猪生产的核供体 细胞。5．Oxamflatin对转基因克隆猪胚胎发育的影响体细胞核错误的表观遗传重编程是引起克隆低效率的主要原因，有研 究表明，通过添加组蛋白去乙酰化酶抑制剂，如oxamflat in能够提高体细 胞核移植胚胎的发育潜能，本实验研究oxamflatin对猪转基因克隆胚胎发 育的影响。结果如下：用lpM的oxamflatin处理克隆胚胎12h