可促进raav在人肝星状细胞lx-can promote raav in human hepatic stellate cells lx.docx

摘要肝纤维化是继发于肝脏炎症或损伤后组织修复的代偿反应。肝星状细胞的 活化造成肝脏细胞外基质(extracellular matrix, ECM)过度沉积是导致肝纤维化 的中心环节。若得不到及时治疗，肝纤维化会向肝硬化甚至肝癌发展。而近年 来，基因治疗以其靶向性高，给药剂量低等优势逐渐成为药物开发的新方向。 开发抗肝纤维化基因药物也成为治疗肝纤维化的研究热点。基于腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）开发的基因治疗载体—— 重组腺相关病毒（Recombinant adeno-associated virus，rAAV）载体，被认为是 最有前景的基因治疗载体之一，并在临床实验中取得了一定的成绩。但其体内 基因表达效率太低是限制 rAAV 载体临床应用的关键问题之一。而高剂量的 rAAV 基因药物会引发机体免疫反应。因此，rAAV 基因药物研究的当务之急之 一是提高其基因表达效率。基于此，本论文设想寻找一种能够进一步提高 rAAV 载体转染纤维化肝脏的 有效手段来提高肝纤维化治疗的有效性。通过查阅相关文献发现，RNAi 极有可 能是一种有效手段。本论文选用在肝纤维化过程中发挥关键性作用的肝星状细胞（LX-2），在细 胞水平，从 1719 个 miRNA 中筛选出能够在 LX-2 细胞中促进 rAAV 表达效率的 miRNA，并通过生物信息学的方法分析其靶基因以及涉及的信号通路，预测其 可能机制。最终确定能够调节多条信号通路的 miR-3133 为进一步研究对象，推 测其可能通过其靶基因 CBL 参与的 ErbB 信号通路实现 rAAV 表达的提高。本文 选取可能影响泛素化途径的 CBL 基因进行了验证。实时荧光定量 PCR 分析（qReal-time PCR）结果证实了 miR-3133 能够下调 CBL，说明了这种预测方法 的可行性，也表明本文对 miR-3133 通过其靶基因 CBL 参与的 ErbB 信号通路实 现 rAAV 表达的提高的预测可能是正确的。同时，miR-3133 还能够下调促进肝 纤维化的 TGF-β 在体内的受体——TGFBR1 的表达，这使得 miR-3133 可能能够 从抑制 LX-2 的活化和提高 rAAV 表达两个方面同时优化治疗效果。本课题筛选得到一种提高 rAAV 载体在 LX-2 细胞中表达的 miRNA，并对可 能靶基因进行了初步验证，为开发 rAAV-miRNA 基因药物治疗肝纤维化提供理 论研究基础。I关键词： 重组腺相关病毒基因治疗肝纤维化microRNAIIAbstractHepatic ?brosis is a response to chronic liver injury. The central event of hepatic fibrosis is the activation of hepatic stellate cells (HSCs), which promotes the excess production of extracellular matrix. It will develop into cirrhosis without treatments, even hepatocellular carcinoma. In recent years. Gene therapy become one of the new area for hepatic ?brosis medicinal development because of its targeted drug delivery and low dose. Developing gene drugs is a new research hotspot of anti-fibrosis.Recombinant adeno-associated virus (Recombinant AAV, rAAV) vectors is based on Adeno-associated virus (AAV), is recognized as one of the most promising therapy vectors for gene therapy. Some clinical trials with rAAV achieved certain results.However, the low transduction efficiency of gene expression in vivo is one of the restriction in the clinical application of rAAV vectors. But high doses of the