抗菌肽lfampinblfcinb基因的设计合成及表达产物的活性鉴定-design and synthesis of antibacterial peptide lfampinbfcinb gene and activity identification of its expression products.docx

英文缩略表英文缩写英文全称中文全称AmpAmpicillin氨苄青霉素CarbBpEDTASDSPCRPBSODLBCarbenicillinbasepairEthyleneDiamineTetraaceticAcidSodiumDedecylSμLfatePolymeraseChainReactionPhosphateBufferedSalineOpticaldensityLbroth羧苄青霉素碱基对乙二胺四乙酸十二烷基硫酸钠聚合酶链式反应磷酸盐缓冲液光密度L肉汤论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得江苏科技大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：日期：学位论文使用授权声明江苏科技大学有权保存本人所送交的学位论文的复印件和电子文稿，可以将学位论文的全部或部分上网公布，有权向国家有关部门或机构送交并授权其保存、上网公布本学位论文的复印件或电子文稿。本人电子文稿的内容和纸质论文的内容一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅。研究生签名：导师签名：日期：日期：第1章绪论1.1研究背景及意义抗生素至发现以来，挽救了无数病人的生命，抗生素已经离不开我们的生活。世界卫生组织建议抗生素在医院内使用率不超过30%，而中国却达70%左右，抗生素在药店随便买，到医院随便开[1]。据统计资料显示，我国每年有8万人死于过度使用抗生素，7岁以下儿童因不合理使用抗生素造成耳聋的数量高达30万人[2]。近年来，抗生素不仅在疾病防治中大量使用，在食品、卫生保健、动物饲料等方面也无限制使用，结果抗生素的使用效果逐年下降，一些抗药的超级病菌，抗药病毒不断涌现，给疾病防治带来极大困难。我们在合理使用抗生素的同时，应当研制安全、高效、不易产生抗药性的新型药物来替代和辅助传统抗生素提高抗菌效果。牛乳铁蛋白（bLF）具有抗菌、抗病毒、消除炎症和免疫调节等多种生物学功能。牛乳铁素（LfcinB）位于bLF氨基端第17～41位氨基酸，由bLF在酸性条件下经胃蛋白酶消化获得，具有比bLF更强的抗菌活性。牛Lactoferampin（LfampinB）位于bLF氨基端第268～284位氨基酸，由bLF在蛋白水解条件下产生，抗菌活性强于bLF，有研究证实与LfcinB形成的嵌合结构肽抗菌活性显著高于两者。本研究在此背景下设计合成了LfampinB/LfcinB基因，通过原核表达与真核表达及其表达产物的抗菌活性测定研究制备出一种抗菌肽，用于疾病的防治。乳铁蛋白、乳铁素以及Lactoferampin的研究进展乳铁蛋白、乳铁素以及Lactoferampin的发现乳铁蛋白（LF）是一种分泌性糖蛋白，最初由SorensenM和SorensenSPL于1939年从牛乳中发现[3]。1953年，Polis等在制备乳过氧化物酶时得到了它的粗制品[4]。1960年由Groves、Johanson、Montreuil等科学家分别从人乳中分离获得人乳铁蛋白（hLF）[5]。到目前为止，已经发现包括人、小鼠、牛、马、猪、山羊、绵羊、水牛和骆驼9种哺乳动物LF的氨基酸序列[6]。LF存在于哺乳动物的消化、呼吸和生殖系统的外分泌液如唾液、泪液、精液等中，在血浆与羊膜液中也有发现，但是以乳汁特别是初乳中含量最高[7]。较之人、马、猪、狗、山羊、兔、豚鼠、大鼠、和小鼠的乳汁中LF含量，牛乳中含量最丰富[8]。另外，在炎症反应刺激时，中性粒细胞和粘膜上皮细胞也能够分泌乳铁蛋白。1995年，Lohuis等发现LF可能有潜在的治疗牛乳房炎的作用。后来研究发现，当牛发生乳房炎时，牛乳中LF的含量明显增高[9]。1992年，科学家发现bLF与hLFN端有一抗菌区域，并命名为乳铁素（Lfcin）。LfcinB是bLFN端第17～41位氨基酸组成的阳离子小肽，而人乳铁素（LfcinH）最初认为是hLFN端第1～45位氨基酸通过2个二硫键形成的肽链，最近的光谱学研究证明其是由hLFN端第1～49位氨基酸形成的单一连续的肽链[10]。2004年，科学家发现在LFN端第268～284位氨基酸同样具有类似于Lfcin的抗菌活性区域，并命名Lactoferampin（简称Lfampin）[11]。后来发现，LfampinB的氨基端有1个由天冬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸（Asp-Leu-Ile）组成的螺旋帽结构，增加了氨基端α螺旋的稳定性，从而增强了Lfampin的抗菌活性[10]。乳铁蛋白、乳铁素以及Lactoferampin的分子结构乳铁蛋白的分子结构LF是一种铁结合