雷帕霉素通过mtornf-rapamycin passes through mtornf.docx

雷帕霉素通过mTOR/NF-κB/LOX-1通路抑制人脐静脉内皮细胞摄取氧化低密度脂蛋白中文摘要目的：Ox-LDL在血管内皮细胞的聚集与其入胞增加及入胞后的降解障碍有关，我们的前期工作发现雷帕霉素能够通过增加自噬-溶酶体活性抑制人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）聚集。本研究旨在探讨雷帕霉素抑制HUVECs中ox-LDL聚集的作用是否与其抑制ox-LDL的入胞有关，并探讨其机制。方法：采用MTT检测不同浓度雷帕霉素对细胞活力的影响，流式细胞技术检测不同浓度雷帕霉素对Dil-ox-LDL在HUVECs聚集的影响，采用活细胞工作站观察Dil-ox-LDL摄取入胞实时变化。定量PCR及westernblot法检测植物凝集素样氧化低密度脂蛋白受体-1（LOX-1）的转录及蛋白表达水平；应用瞬时转染技术构建mTOR及NF-κB基因敲减细胞模型；运用不同的NF-κB抑制剂为工具药抑制NF-κB活性；采用westernblot法检测mTOR，IκBα及磷酸化mTOR，IκBα的表达；采用流式细胞技术检测抑制mTOR及NF-κB对Dil-ox-LDL聚集的影响，免疫荧光观察NF-κB亚单位p65的亚细胞分布情况；应用westernblot法探讨蛋白上下游关系。结果：1.MTT结果提示5~80nM雷帕霉素不会对细胞活力产生显著影响，流式细胞技术提示雷帕霉素能浓度依赖性减少HUVECs内Dil-ox-LDL的聚集，活细胞工作站结果进一步证实10nM雷帕霉素能抑制Dil-ox-LDL的入胞。2.ox-LDL呈浓度及时间依赖性增加HUVECsLOX-1蛋白的表达。雷帕霉素能够浓度依赖性地逆转ox-LDL诱导的LOX-1基因、蛋白表达增加。3.westernblot结果提示ox-LDL能够诱导mTOR的磷酸化（p0.001），而雷帕霉素能够抑制ox-LDL诱导的mTOR,p70s6k磷酸化（p0.01），流式细胞仪结果表明敲I中文摘要雷帕霉素通过mTOR/NF‐κB/LOX‐1通路抑制人脐静脉内皮细胞摄取氧化低密度脂蛋白减mTOR后也能显著抑制Dil-ox-LDL的聚集（p0.05）。westernblot以及免疫荧光结果提示ox-LDL能够引起IκBα的磷酸化（p0.001），并能够促进p65入核，而雷帕霉素则能够抑制IκBα的磷酸化（p0.01），并且显著减少p65入核，雷帕霉素单独处理同样能够浓度依赖性地抑制IκBα的磷酸化。流式细胞仪结果提示应用NF-κBsiRNA及NF-κB抑制剂也能够显著抑制Dil-ox-LDL在HUVECs的聚集（p0.01）。Westernblot结果提示运用mTORsiRNA，NF-κBsiRNA以及NF-κB抑制剂均能够显著减少ox-LDL诱导的LOX-1蛋白表达（p0.001），运用mTORsiRNA能够抑制ox-LDL诱导的IκBα的磷酸化（p0.01），然而运用NF-κBsiRNA以及NF-κB抑制剂却不能抑制mTOR的磷酸化。结论：雷帕霉素能够通过mTOR/NF-κB/LOX-1通路抑制HUVECs对ox-LDL的摄取。本研究可能为动脉粥样硬化的治疗提供新的靶点。关键词：雷帕霉素；ox-LDL；mTOR；NF-κB；LOX-1作者：周衍德指导教师：谢莹张艳林RapamycininhibitstheuptakeofoxidizedlowdensitylipoproteininhumanumbilicalveinendothelialcellsviathemTOR/NF-κB/LOX-1pathway.AbstractObjective:Previously,wefoundthatrapamycincouldinhibitoxidizedlowdensitylipoprotein(ox-LDL)accumulationinhumanumbilicalveinendothelialcells(HUVECs),andthiseffectwasrelatedtoitsroleinincreasingtheactivityofautophagy-lysosomepathway.Lectin-likeoxidizedlow-densitylipoprotein-1(LOX-1)isthemajorreceptorforox-LDLuptakeinHUVECs.Inthisstudy,wesoughttoascertainifrapamycincouldalsoreduceox-LDLuptakeinHUVECsandinvestigatetheunderlyingsignalingmechanisms.Methods:MTTASsaywasappliedtoexaminecellviabil