DNA酶切、连接、转化和重组子筛选和鉴定.docx

DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定摘要：以质粒pUC19作为载体、λDNA作为外源片段来源，限制性核酸内切酶HindⅢ分别对其进行单酶切，产生相同的黏性末端后用T4 DNA连接酶连接从而构建重组质粒，用CaCl2 制备E.coli感受态细胞，并用热激法进行重组质粒的转化，培养并用α-互补筛选法进行筛选，最后用试剂盒提取质粒DNA进行检测。根据在实验过程中所遇到的问题及对结果的分析，探讨关键步骤及影响转化/重组效率的相关因子，并说明实验过程中应当注意的问题。关键词：DNA酶切 连接 感受态细胞 转化 重组子的筛选与鉴定引言：实验目的为掌握限制性核酸内切酶的分类、特性与作用原理以及对DNA进行酶切的实验技术，掌握DNA连接酶的作用原理以及利用T4 DNA连接酶构建重组DNA分子的实验技术，掌握利用CaCl2 制备E.coli感受态细胞的原理和方法，掌握α-互补筛选法的原理，学习用试剂盒提取质粒DNA的方法，复习琼脂糖凝胶电泳的原理和方法，掌握利用琼脂糖凝胶电泳筛选重组质粒。 限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（一般4-8bp），并在此处切割DNA双链的核酸内切酶。主要存在于原核生物，是原核生物自我保护的一种机制（限制修饰系统）。限制性核酸内切酶分为三类，Ⅰ型与Ⅲ型：识别位点与切割位点不一致，故同一种酶切产生的片段长度不同；Ⅱ型：固定的识别序列处切割，故每次都产生完全相同的片段。影响限制性内切酶活性的因素有：DNA纯度，DNA甲基化程度，反应温度，DNA的分子结构，缓冲液。 DNA连接酶在体内合成DNA某条链上丢失的磷酸二酯键，体外连接反应中，DNA连接酶则需要合成两个磷酸二酯键。T4-DNA连接酶不需要PEG等就能进行平端的连接，所以实验中绝大多数情况下使用T4-DNA连接酶。影响DNA连接的因素有：温度、时间、酶量、缓冲体系、DNA末端的性质及浓度、DNA片段的大小等。载体环化与串联（重组）的比例取决于两个参数：j：DNA分子的一个末端在同分子的另一末端附件的有效浓度（假设DNA在溶液中呈无规卷曲），对于给定长度的DNA分子来说j是一个常数，与DNA浓度无关；i：溶液中所有互补末端浓度的测量值。理论上，当j=i时，载体自连与重组的概率相当；当ji时，有利于重新环化（自连）；当ji时，则有利于形成多联体（重组）。连接反应体系：1.足量的载体DNA（pUC19（≈2.7kb): 连接反应中应加入20-60ng/μL）；2.载体与插入片段的摩尔数比例为1:1到1:3（pUC19=2.7 kb，加入量50ng，假设插入片段为2.3kb，加入量为：2.3/2.7*50*1=42.5ng；或者2.3/2.7*50*3=130ng）。 感受态指宿主细胞最容易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，由受体菌的遗传性状所决定，同时也受菌龄及环境因子的影响。细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入总体积15%的甘油，-70℃保存（有效期6个月）。除自然转化外，细胞经过一些特殊方法（如CaCl2等化学试剂）处理后，细胞膜的通透性发生变化，也可以成为易于接受并转化外源DNA的感受态细胞。影响感受态细胞制备及转化的因素有：细胞的状态、DNA的质量和浓度、试剂的纯度等。 1.材料与方法1.1材料和试剂 Ep管，ddH2O，10*M buffer，pUC19（商品），HindⅢ（15U/μl），λDNA（商品），1×TAE，琼脂糖，EB溶液，10×T4 Ligase Buffer, T4 DNA Ligase（350 U/μl）, E.coli DH5α, LB培养基, 0.1M CaCl2, 麦康凯培养基,Amp, 10xBuffer, dNTP（2.5mM each）, M13F（10μM）, M13R（10μM）, Taq酶（5u/μl）, 牙签, 37℃温箱。1.2方法1.2.1酶切及酶切产物的电泳检测 一组：向Ep管中加入ddH2O 64.0μl，10*M buffer 8.0 μl，pUC19（商品）4.0μl，HindⅢ（15U/μl）4.0μl，共80.0μl。 二组：向Ep管中加入ddH2O 70.0μl，10×M buffer 10.0 μl，λDNA（商品）15.0μl，HindⅢ（15U/μl）5.0μl，共100.0μl。 三组：向Ep管中加入ddH2O 13.0μl，10*M buffer 2.0 μl，pUC19（各组）4.0μl，HindⅢ（15U/μl）1.0μl。 分别混匀，离心2s，使样品集中于管底。在37℃恒温水浴锅中反应1h以上或者过夜。酶切反应完全后置65℃恒温水浴锅中保温10-15mi