酶分离纯化第二节 发酵液预处理.pptVIP

1 悬浮液的预处理 1.2 预处理目的 a 改变发酵液物理性质 b 产物转入液相中 c 除去发酵液中部分杂质 1.3 预处理方法 1.3.1高价无机离子的去除 Ca2+ 草酸 Mg2+ 三聚磷酸钠 Fe3+ 黄血盐 （普鲁士蓝） 1.3.2蛋白质去除 加热 调pH (草酸，无机酸或碱) 有机溶剂 蛋白沉淀剂 1.3.3 凝聚与絮凝 使细胞、细胞碎片及大分子物质聚结成较大颗粒，便于提高过滤速率 凝聚：指在电解质作用下，由于胶体粒子(10-100nm)之间双电层排斥作用降低，电位下降，而使胶体体系不稳定相互聚集成大粒子（1mm）的现象。机理：a 中和粒子表面电荷 b 消除双电层结构 絮凝：高分子聚合物将胶体粒子交联成网状，形成絮凝团的过程。机理：架桥作用 絮凝剂应用优化 a 用量控制 最佳用量为粒子表面积约有一 半被聚合物覆盖时所用的絮凝剂量。 b pH 控制 c 固体浓度与粒子尺寸分布 d 电解质含量 e 后续工艺要求 常用的凝聚剂与絮凝剂 凝集剂：铝盐，铁盐，钙盐，锌盐 絮凝剂：阳离子型：阳离子聚丙烯酰胺，聚丙烯酸二烷基胺乙酯，聚二烯丙基四胺盐。阴离子型：聚丙烯酸钠，聚苯乙烯磺酸，木质素磺酸盐非离子型：聚氧乙烯天然类：甲壳素 2 固液分离 常用的分离方法有： 过滤与膜分离、离心分离等 2.1过滤 过滤是借助过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术。 常用的有滤纸、滤布、纤维、多空陶瓷和各种高分子膜(膜分离) 过滤的分类与特性 改善过滤方法 助滤剂：质地坚硬不可压缩性固体机理：表面吸附胶体及不可压缩型格子结构使用方法：a 预先制成滤饼b 助滤剂混入悬浮液中一起过滤常用助滤剂：硅藻土，珍珠岩，活性炭应用优化因素 a 单位质量助滤剂的滤液最大产量 b 使用周期 c 流速 2.2 离心分离 指借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小和不同密度的物质分离的技术。离心是研究如细胞核、线粒体、高尔基体、溶酶体和微体，以及各种大分子基本手段。一般认为，转速为10~25Kr/min的离心机称为高速离心机；转速超过25Kr/min，离心力大于89Kｇ者称为超速离心机。目前超速离心机的最高转速可达100Kr/min，离心力超过500Kg。 （一）、差速离心（differential centrifugation） 在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的物质。 由于各种物质在大小和密度上相互重叠，而且某些慢沉降颗粒常常被快沉降颗粒裹到沉淀块中，一般重复2～3次效果会好一些。 差速离心只用于分离大小悬殊的物质，更多用于分离细胞器。通过差速离心可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。 速度逐渐提高，样品按大小先后沉淀 （二）、密度梯度离心（density gradient centrifugation） 用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。这类分离又可分为速度沉降和等密度沉降平衡两种。密度梯度离心常用的介质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖。 A等速度沉降，B等密度沉降 1、速度沉降 速度沉降（velocity sedimentation）主要用于分离密度相近而大小不等的物质。这种降方法所采用的介质密度较低，介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。 颗粒在十分平缓的密度梯度介质中按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离。 2、等密度沉降 等密度沉降（isopycnic sedimentation）适用于分离密度不等的颗粒。 颗粒物质在连续梯度的介质中经足够大离心力和是够长时间则沉降或漂浮到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的颗粒分离。 2、等密度沉降 等密度沉降通常在较高密度的介质中进行。介质的最高密度应大于被分离组分的最大密度，而且介质的梯度要求较高的陡度，不能太平缓。再者，这种方法所需要的力场通常比速率沉降法大10~100倍，故往往需要高速或超速离心，离心时间也较长。大的离心力、长的离心时间都对细胞不利。 密度梯度混合器 密度梯度混合器操作 1、稀溶液置于B室，浓溶液置于混合室B，保持液面平等 2、开动搅拌器 3、同时打开两阀门 4、离心管收集 注意： 1、若浓溶液置于B室，稀溶液置于A室，则梯度液导流管须插入离心管底部，让后流入的高浓度混合液将先流入的低浓度的混合液顶起来。 密度梯度混合器操作 2、离心过程中，区带位置和宽度随离心时间的不同而改变。若离心时间过长由于颗粒的扩散作用，会使区带变宽，影响离心效果，可适当增加离心力缩短离心时间加以解决 密度梯度混合器 固液分离设备