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荧光原位杂交技术在血液病中 的应用 Fluorescent in situ Hybridization (FISH) 山东省立医院检验科 张之芬 一、荧光原位杂交（FISH）技术简介 一、荧光原位杂交（FISH）技术简介 20世纪70年代后期人们开始探讨荧光标记的 原位杂交，即FISH技术。1974年Evans首次 将染色体显带技术和染色体原位杂交联合应 用，提高了定位的准确性。1981年Harper成 功地将单拷贝的DNA序列定位到G显带标本 上，标志着染色体定位技术取得了重要进 展。20世纪90年代，随着人类基因组计划的 进行，由于绘制高分辨人类基因组图谱的需 要，FISH技术得到了迅速的发展和广泛应 用。 二、FISH简单原理 荧光原位杂交技术(Florescence In-Situ Hybridization简称FISH) 通过荧光标记的 DNA探针与待测样本的DNA进行原位杂 交，在荧光显微镜下对荧光信号进行辨别 和计数，从而对染色体或基因异常的细 胞、组织样本进行检测和诊断，为各种基 因相关疾病的分型、预前和预后提供准确 的依据。 它的基本原理是:利用核酸分子单链之间有互 补的碱基顺序，通过碱基对之间非共价键的 形成，出现稳定的双链区，形成杂交的双链. 如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶 DNA与所用的核酸探针 （DNA或RNA）是同 源互补的，二者经变性-退火-复性，即可形成 靶DNA与核酸探针的杂交体。将核酸探针的 某一种核苷酸标记上荧光,经荧光检测体系在 镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位 分析。 三、原位杂交探针特点 三、原位杂交探针特点 原位杂交的探针按标记分子类型分为放射性 标记和非放射性标记。用同位素标记的放射 性探针优势在于对制备样品的要求不高，可 以通过延长曝光时间来加强信号强度，所以 比较灵敏。缺点是探针易衰变、不稳定、自 显影时间长、放射线的散射使得空间分辨率 不高、及同位素操作较繁琐等。采用荧光标 记系统则可克服这些不足，这就是FISH技 术。 FISH探针按标记方法可分为直接标记和 间接标记: 用生物素(biotin)或地高辛 (digoxingenin)标记称为间接标记, 杂交 后需要通过免疫荧光抗体检测方能看到 荧光信号, 因而步骤较多, 操作麻烦, 但 优点是在信号较弱或较小时可经抗原抗 体反应扩大; 直接用荧光素标记DNA或 RNA的方法称为直接标记. 由于直接标记的探针杂交后可马上观察到荧 光信号, 省去了烦琐的免疫荧光反应, 不再需 要购买荧光抗体, 也由于近年来荧光的亮度 和抗淬灭性的不断改进和提高, 直接标记的荧 光探针越来越成为首选, 如Vysis公司的FISH 探针均采用直接荧光标记, 并采用多种不同颜 色的荧光, 方便在同一标本上同时检测多种异 常. 其荧光强度和信号大小都易于在普通荧 光显微镜下观察, 操作过程中也不需要严格避 光, 使FISH过程变得简便而易于操作. 三、FISH探针的类型 LSI :Locus specific identifier 特殊位点探针 CEP:Chromosome Enumeration DNA Probes 着丝粒探针 WCP: Whole Chromosome Paints 全染色体涂抹荧光探针 LSI特殊位点探针：标记了荧光信号的DNA片 段代表了某一个或几个基因位点的全部序列. CEP 着丝粒探针：就是标记荧光的DNA区域位于 染色体的着丝粒部位。通常是在染色体的p11-q11 区域。 WCP全染色体涂抹荧光探针：通过对显微切割的染色体 片段或卫星DNA序列进行PCR，获得全染色体探针，能 对整条染色体进行荧光标记 常用探针结果分析及其临床意义 5p15.2/5q31 CEP7/7q31 CEP8 BCR/ABL (