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“血红蛋白提取和分离”解题指导 　　“血红蛋白的提取和分离”是选修Ⅰ模块《生物技术实践》中的实验内容，其目的是使学生体验从复杂细胞混合物体系中提取生物大分子的基本原理、方法和过程。本节内容主要是能理解凝胶色谱法、电泳法的基本原理，了解缓冲液的组成及其作用；掌握血红蛋白的提取与分离的基本过程和方法，并结合实验操作过程，分析实验和实验的注意事项。 　　■ 一、 实验原理及分析 　　提取和分离蛋白质的原理：利用蛋白质的各种理化特性（如形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等）的差异，由此提取和分离各种蛋白质。 　　1. 凝胶色谱法（分配色谱法） 　　（1） 原理：根据相对分子量的大小分离蛋白质的一种有效方法（分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢）。 　　（2） 凝胶材料：大多数是由多糖化合物（如葡聚糖、琼脂糖等）构成的微小多孔球体，如下图所示。 　　 　　（3） 作用：分离蛋白质，测定生物大分子分子量等。 　　2. 缓冲溶液 　　（1） 原理：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成（如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等），调节缓冲剂的比例可以制成在不同pH范围内使用的缓冲液。 　　（2） 缓冲液作用：在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，保持溶液的pH基本不变。 　　3. 凝胶电泳 　　（1） 原理：在电泳过程中，决定带电分子迁移方向的是带电分子带电性质的差异，决定带电分子迁移快慢的是带电分子形状、大小和电量的不同。 　　（2） 分离方法：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。 　　（3） 分离过程：在一定的pH下，许多生物大分子上可解离的基团就会带上正电或负电。加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质－SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。 　　4. 实验操作 　　（1） 样品处理： 　　① 红细胞的洗涤。 　　洗涤的目的是除去血浆中的杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化。为防止血液凝固，应预先加入柠檬酸钠；采集的血样要及时采用低速短时间离心分离红细胞，然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯。 　　所用洗涤液是五倍于红细胞液的生理盐水；洗涤中用玻璃棒缓慢搅拌，用离心机低速短时离心；洗涤干净的标准是上清液没有黄色。 　　② 血红蛋白的释放。 　　释放的目的是将血红蛋白从红细胞中释放出来。在红细胞液中加入等体积的蒸馏水和40％体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌。红细胞破裂释放出血红蛋白。加入甲苯的目的是溶解细胞膜，有利于血红蛋白的释放和分离。 　　（2） 粗分离： 　　① 分离血红蛋白溶液。 　　目的是从红细胞破碎混合液中分离出血红蛋白溶液。将红细胞破碎混合液进行高速离心处理后，离心管中的溶液分为4层。从上到下依次是：无色透明的甲苯层、白色固体的脂溶性沉淀层、红色透明的血红蛋白溶液层和暗红色的破碎物沉淀层。用滤纸过滤以除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置后分离出血红蛋白溶液。 　　② 透析。 　　目的是除去血红蛋白溶液中的无机盐离子和有机小分子等分子量较小的杂质。将血红蛋白溶液装入透析袋中，放入磷酸缓冲液中透析12 h。 　　5. 凝胶色谱操作（分离纯化） 　　① 凝胶色谱柱的制作。 　　② 凝胶色谱柱的装填： 　　实验所用凝胶是交联葡聚糖凝胶（G－75），其中G表示交联程度、膨胀程度和分离范围；75表示凝胶得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5 g。 　　将凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液，一次性缓慢倒入色谱柱内，使凝胶装填均匀并不能有气泡存在。然后用磷酸缓冲液充分洗涤平衡12 h，使凝胶装填紧密。 　　③ 样品的加入和洗脱： 　　调节缓冲液面：打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。 　　加入蛋白质样品：用吸管将透析后的样品沿管壁环绕移动加到色谱柱的顶端。加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全渗入凝胶层后，关闭出口。 　　调节缓冲液面：加入20 mmol/L的磷酸缓冲液到适当高度。 　　洗脱：连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口，进行洗脱。 　　收集分装蛋白质：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集。 　　④ 纯度鉴定――SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。 　　■ 二、 解题指导及思路点拨 　　1. 题型探究：凝胶色谱法分离蛋白质 　　考生特别要注意对缓冲溶液的组成、作用机理、配制方法等方面的理解。 　　■ 例1 凝胶色谱法分离蛋白质的原理是（ ） 　　A. 根据蛋白质分子的形状 　　B. 根据蛋白质相对分子质量的大小 　　C. 根据蛋白质所