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大鼠发育过程中下丘脑神经元钾离子通道温度效应变化研究 　　摘 要：为了探讨出生后钾离子通道在下丘脑神经元热敏感分化过程中的作用， 采用膜片钳技术研究出生一个月内SD大鼠急性分离神经元的温度效应，结果表明IK电流密度在出生后一个月内变化不大(P0．05)，而IA电流密度则呈现为升高趋势(P0都有不同程度的升高，但相较P1d的神经元来说，温度对P18d的电压依赖性影响更大一些．同时温度对IK和IA的影响是不一样的。IA的Q102，所有这些显示IA通道在神经元温度敏感性的发育分化过程中起着重要的作用。 　　关键词：下丘脑；发育；温度；钾通道 　　中图分类号：Q42；Q494 文献标识码：A 文章编号：1007-7847(2006)01-0024-04 　　中枢性体温调节的本质和调控因素涉及到外 周温度信息电生理信号的编码机制，在这种环境 信号转化为生物信号的过程中，视前区―下丘脑 前部(POAH)的神经元起着重要的作用，这种重 要作用体现在不同的离子通道参与了温度信息的 整合和反应。神经元的温度敏感性的形成依赖 于内在的离子通道敏感机制和突触输入的特性。 电压依赖性钾通道的活动能够有效地调节神经元 的膜兴奋性，被认为是温度敏感神经元温度敏感机 制和放电率之间建立有效联系的重要桥梁。而大 鼠神经元的发育和突触形成一直持续至出生后的 最初几周，在此期间，神经元的温度敏感性逐步 升高，这种对涉及到下丘脑温度敏感性的表观遗 传学变化的研究有利于最终揭示“体温调定点”学 说。为此，我们检测了发育阶段大鼠下丘脑神经 元钾离子通道的温度效应。 　　 　　1 材料和方法 　　 　　1．1 下丘脑脑片制作和神经元急性分离 　　分别取出生后(3±2)d、(18±2)d和(30± 2)dSD大鼠，快速断头去脑，分离出下丘脑，迅速 置于0℃的高浓度蔗糖液中，用振动切片机 (WorldPrecision lnstruments MA752)切割成400 lam厚的脑片，在HBSS(Sigma)液中漂洗3次后置 于95％O2和5％CO2饱和的EBSS(Sigma)液中孵 育1h，用针头将脑片分离成小块组织后放入32℃ 通100％02的含1-1．2 g／L细菌蛋白酶XⅣ (Sigma)的HBSS溶液中进行消化，漂洗后用不同 管径的Paster吸管吹打成细胞悬液，静置待细胞 贴壁。 　　 　　1．2 电生理记录 　???玻璃微电极拉制后尖端直径为1～2 μm，充 满电极内液后阻抗为4-S MΩ，标准电极外液成 分(mmol／L)：NaCl 120，MgCl2 1，CaCl22，CsCl 1， KCl 2．8，8lucose 10，HEPES10，用NaOH调pH至 7．4．标准细胞内液成分(mmol／L)：CsCl 120， MgCl2 1，EGTA 10，HEPES 10，Thapsigargin 2 txmol／L，用CsOH调pH至7．3，记录在20～24 ℃的室温下进行．实验用CEZ2400膜片钳放大 器，当电极尖端与细胞膜之间形成大于1 GΩ的 高阻密封后，即形成细胞贴附式。全细胞记录模 式则是在此基础上负压破膜，使电极内液与细胞 内液相通后形成，调节放大器的电容-慢控制 (C―slow)和电导―串联控制(G-series)来抵消瞬时 电流，电流或电压信号经放大器放大后通过接口 与计算机相连，经1kHz滤波，结果分析等均借助 计算机用pCLAMP 9．0软件完成．浴槽液成分 (mmol／L)为NaCl(125)、HEPES(10)、KCI(2，5)、 MgCl2(2)、CaCl2(1)、D－glucose(10)(pH 7．2with NaOH)，电极液成分(mmol／L)为K-asparate (120)、NaCl(20)、CaCl2(2)、EGTA(0．2)、HEPES (10)(pH 7．2with KOH)。 　　 　　1．3 方法 　　利用控温浴槽(TC-202A，HARVARDHK)改 变神经元的环境温度，设置3个温度区间，每个 区间的温度相差为3℃。这3个温度区间为， 32～33℃、36-37℃、39-40℃，文中没有涉及 温度处理的记录则是在室温下完成(20～25℃)． 　　 　　1.4 数据记录和分析 　　单通道的开放概率根据下式计算得出： 　　其中T为记录的时间，t为通道的开放时间， i为开放的通道数目。当通道为一级开放时， NPo=PoIA人和人电流幅度的计算按照HU(HU H J etal，1998)和ZHANG(ZHANGC O etal.2001) 等的方法，IA用电流锋值来计算，Ik用158ms处 的电流值来计算。离子通道的Q10表示的是通道 活动对温度的敏感度，根据下列公式计算得出：