二硫键稳定人源性抗bfgf双链抗体在毕赤酵母中表达 纯化及鉴定-expression, purification and identification of disulfide - stabilized human anti - bfgf double-stranded antibody in pichia pastoris.docxVIP

目录摘要IAbstractII目录III第一部分前言11bFGF促进肿瘤血管生成12bFGF参与肿瘤的发生发展22.1bFGF/FGFR信号转导途径及其与肿瘤的发生发展22.2bFGF与乳腺癌33小分子抗体44毕赤酵母表达系统55研究目的及意义6第二部分材料与方法91实验材料91.1菌株、质粒及细胞株91.2主要试剂及耗材91.3主要试剂的配制91.4主要仪器设备112实验方法122.1人源性抗bFGFds-Diabody基因的扩增及克隆载体的构建122.2酵母重组表达载体pPICZαA-ds-Diabody的构建162.3重组质粒转化毕赤酵母及高拷贝转化子的加压筛选172.4ds-Diabody酵母工程菌的诱导表达及鉴定192.5抗体ds-Diabody的大量表达及纯化21ds-Diabody与抗原bFGF结合活性的ELISA检测23ds-Diabody的稳定性检测242.8肿瘤细胞增殖抑制实验242.9肿瘤细胞划痕修复实验252.10肿瘤细胞侵袭实验25UVECs体外成管实验26HUVECs迁移实验26ds-Diabody对bFGF信号通路的影响27第三部分结果与分析293.1抗bFGFds-Diabody基因的克隆及酵母表达载体构建293.2重组酵母的筛选、表达优化及鉴定293.2.1高拷贝转化子的筛选鉴定293.2.2重组酵母的表达条件优化303.3酵母表达产物的纯化鉴定31ds-Diabody的浓度测定32ds-Diabody与bFGF的结合活性及稳定性323.6ds-Diabody对肿瘤细胞增殖的抑制作用343.7ds-Diabody对MCF-7细胞迁移的抑制作用353.8ds-Diabody对MCF-7细胞侵袭的抑制作用36ds-Diabody对HUVECs细胞成管的抑制作用36ds-Diabody对HUVECs细胞迁移的抑制作用37-Diabody对PI3K/Akt和MAPK/ERK信号通路的抑制作用38第四部分讨论与结论40第五部分小结与展望421小结422展望42参考文献43附录49硕士期间发表论文情况49硕士期间参加学术活动49致谢51第一部分前言1bFGF促进肿瘤血管生成许多临床和实验研究证实，除了肿瘤细胞的自身增殖动力外，肿瘤血管生成是对肿瘤生长最重要的影响因素，也是肿瘤恶性行为如肿瘤转移及浸润所必需的。转移细胞必须通过几道屏障，进入原发瘤的血管，在血液循环中存活，着床与靶器官的血管床，然后移出血管，在靶器官中生长并诱导新的血管生成。因此原发瘤的血管生成是先于肿瘤细胞的脱落扩散而发生的，肿瘤血管生成是肿瘤生长和转移的限速步骤。总之，肿瘤转移依赖于肿瘤血管生成。同时，新生毛细血管也为癌细胞进入血液循环提供通路，促进肿瘤侵袭。血管生长因子可以通过刺激肿瘤血管新生来促进肿瘤细胞的生长、增殖、迁移和侵袭等[1]。血管生成因子在新生血管“出芽”时能够显著增加内皮细胞Ⅳ型胶原酶等蛋白水解酶的表达，导致血管基底膜的降解，有利于内皮细胞和肿瘤细胞侵入周围基质，发生迁移和增殖，最后分化为新的血管，同时也促进肿瘤细胞的侵袭。肿瘤血管形成的机制非常复杂，目前研究最多的就是一系列促血管新生因子参与其中，如碱性成纤维细胞生长因子（basic?broblastgrowthfactor,bFGF）和血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)。这些因子由肿瘤细胞自身产生或由侵润在肿瘤组织中的炎症细胞（如巨噬细胞）分泌。并且多种肿瘤组织，如肺腺癌、肝癌、黑色素瘤、脑胶质瘤、横纹肌肉瘤等，高表达bFGF和VEGF及其受体[2-3]。因此，国内外研制以VEGF和bFGF为靶点的抗血管新生药物被认为是临床治疗肿瘤的有效方法，比传统的化疗药物更具有安全性，且无明显细胞毒副作用，不会产生广谱耐药性。之前研究认为，抗血管生成药物治疗不会诱导肿瘤耐药性，原因在于这些药物攻击的靶点是基因组成比较稳定的内皮细胞[4]。但近年临床研究发现，抗血管生成治疗本身也会诱导肿瘤耐药[5]。产生的机制主要有：一是肿瘤分泌的血管刺激因子存在多样性。当肿瘤分泌的某种主要的血管生长因子受到抑制时，肿瘤细胞会分泌其他生长因子来“避开”对抗药物的抑制作用，如癌症患者长期使用针对VEGF的贝伐单抗(Bevacizumab)会产生耐药性，且用药后bFGF会代偿性地升高[6-7]。此外，VEGF/VEGFR通路本身也存在异质性。尽管在大多数肿瘤中，VEGF-A165/VEGFR2是通路中最主要的效应分子，证据表明其他类型的VEGF及其受体在某些肿瘤或某种情况下起主导作用。二是通过改进血管结构来抵御抗血管生成治疗。当肿瘤生长长期受到VEGF/VEGFR拮抗剂治疗时，肿瘤细胞会通过分泌PDGF吸引更多的周细胞以改善肿瘤血管的结构，从而