发光免疫分析技术概述.pptVIP

电化学发光免疫分析（electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA）是以电化学发光剂三联吡啶 钌标记抗体(抗原)，以三丙胺(TPA)为电子供体， 在电场中因电子转移而发生特异性化学发光 反应，它包括电化学和化学发光两个过程。 二、电化学发光免疫分析 磁性微粒为固相载体包被抗体(抗原)，用三联吡啶钌标记抗体(抗原)，在反 应体系内待测标本与相应的抗原 (抗体)发生免疫反应后，形成磁性微粒包被抗 体-待测抗原-三联吡啶钌标记抗体复合物，这时将上述复合物吸入流动室，同时 引人TPA缓冲液。 当磁性微粒流经电极表面时，被安装在电极下面的电磁铁吸引住，而未结合 的标记抗体和标本被缓冲液冲走。与此同时电极加压，启动电化学发光反应，使 三联吡啶钌和TPA在电极表面进行电子转移，产生电化学发光，光强度与待测抗 原浓度成正比。 电化学发光免疫分析 电化学发光免疫分析示意图 以TSH为例： 第一步： 结合了活化的三联吡啶钌衍生物即[Ru(bpy)3]2+ + N羟基琥珀酰胺酯（NHS）的TSH抗体和结合 了生物素的TSH抗体与待测血清同时加入一个反应杯中，孵育9分钟。 第二步： 将被链霉亲和素包被的磁珠加入反应杯中，再次孵育9分钟，使生物素通过与亲和素的结合将磁珠、 TSH抗体连接为一体，形成双抗体夹心法。 下一步，蠕动泵将形成的[Ru(bpy)3]2+－抗体－抗原－抗体－磁珠复合体吸入流动测量室，此 时，磁珠被工作电极下面的磁铁吸附于电极表面。同时，游离的TSH抗体（与生物素结合的和与[Ru (bpy)3]2+结合的抗体）也被吸出测量室。紧接着，蠕动泵加入含三丙胺（TPA）的缓冲液，同时电 极加电压，启动ECL反应过程。发光剂[Ru(bpy)3]2+和电子供体TPA在阳极表面可同时各失去一个 电子而发生氧化反应，使二价的[Ru(bpy)3]2+被氧化成三价，后者是一种强氧化剂；另一方面， TPA 被氧化成阳离子自由基TPA+q，后者很不稳定，可自发失去一个质子（H+），形成自由基 TPAq，这是一种很强的还原剂，可将一个电子给三价的[Ru(bpy)3]3+，使其形成激发态的[Ru (bpy)3]2+，而TPA自身被氧化成二丙胺和丙醛。激发态的[Ru(bpy)3]2+通过荧光机制衰减，发射 出一个波长620nm的光子，重新生成基态的[Ru(bpy)3]2+。该过程在电极表面周而复始地进行， 产生许多光子，光电倍增管检测光强度，光强度与[Ru(bpy)3]2+的浓度呈线性关系，故可测出待测 抗原的含量。 最后，终止电压，移开磁珠，加入清洗液冲洗流动测量室，准备下一个样品测定。 化学发光酶免疫分析（chemiluminescence enzyme 　immunoassay，CLEIA）是用参与催化某一化学发光反应的酶如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶(ALP)来标记抗原或抗体，在与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物，经洗涤后，加入底物(发光剂)，酶催化和分解底物发光，由光量子阅读系统接收，光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，处理信号计算出测定物的浓度。 三、化学发光酶免疫分析 该分析系统采用辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体(或抗原)， 在与反应体系中的待测标本和固相载体发生免疫反应后，形成固 相包被抗体-待测抗原-酶（HRP）标记抗体复合物，这时加入鲁米 诺发光剂、H2O2和化学发光增强剂使产生化学发光。 （一）HRP标记化学发光免疫分析 HRP标记化学发光免疫分析 该分析系统以碱性磷酸酶 标记抗体(或抗原)，在与反应体系 中的待测标本和固相载体发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待 测抗原-酶标记抗体复合物，这时加入AMPPD发光剂，碱性磷酸酶 使AMPPD脱去磷酸根基团而发光。 （二）AKP标记化学发光免疫分析 AKP标记化学发光免疫分析 加样品、磁颗 粒子、试剂 孵育，使反 应物结合 清洗去除未 结合物质 加入底物 产生信号 孵育，促使信 号的产生 信号检测 分析步骤--一步法 小 结 发光指分子或原子中的电子吸收能量后，由基态跃 迁到激发态，然后再回到基态，并释放光子的过程。 化学发光是吸收了化学反应过程中所产生的化学能 使分子激发而发光。 化学发光免疫分析是将化学发光与免疫反应相结 合，用于检测微量抗原或抗体的标记免疫分析技 术，分为直接化学发光免疫分析，化学发光酶免疫 分析和电化学发光免疫分析。 * * * 化学发光免疫分析技术 化学发光免疫分析技术 慨 述 - 化学