3730测序原理及基本峰图分析..pptVIP

测序产物降解峰 特征：在220、450bp附近G碱基降解，峰型扩散。 （1）Chromas （2）Sequence Scanner v1.0 （3） Sequencing Analysis 5.2 优点：简单方便，可用于直观的查看峰图序列。有查找以及互补反转功能。 缺点：不能查看原始信号 优点1：操作简单，可以整版查看峰图质量，可显示原始信号 优点2：软件对峰图质量有初步判断（trace score），并用颜色区分等级。 功能大致与sequence scanner相同，多了重新分析的功能，可以利用这个功能对序列长度进行批量修改，也可以对下机后因信号转换产生的问题峰图进行重新分析。 * 影响酶活性 * 图来自ABI * 引物形成二聚体导致无信号 测序反应原理 —双脱氧链末端终止法〔Sanger法【1977； Fred Sanger 】） 在包括DNA聚合酶、DNA模板、单链寡核苷酸引物、4种dNTP（dATP、dGTP、dTTP和dCTP）及 4种ddNTP（ddATP、ddGTP、ddTTP和ddCTP）的测序反应体系中，DNA聚合酶在模板链指导下，不断地逐个将dNTP加到引物的3’-OH末端，使引物延伸，合成出新的与模板互补的DNA链。在链的延长过程中一旦加入双 脱氧核苷三磷酸（ddNTP），由于其双脱氧核糖的3’位置缺少一个羟基，不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，链终止延伸。 形成一系列具有相同5’-引物端和以ddNTP残基为3’端结尾的长短不一的片段的混合物，通过毛细管电泳并经过分析从而获得模板DNA的核苷酸序列。 “双脱氧末端终止”的含义 PCR反应 测序反应 DNA 聚合酶 Taq酶 测序酶 引物 一对 单向 底物 dNTP dNTP+ddNTP* 模板 量少，质量要求低 质量要求高 产物 等长的DNA片段 相差一个碱基的一系列片段 荧光标记 无 bigdye V3.1 测序产物 指数扩增 线性扩增 测序反应与PCR反应的比较 正 常 峰 图 1 问 题 峰 图 2 基本峰图分析 正 常 测 序 结 果 长片段PCR——峰图 信号图 短片段PCR——峰图 -- 信号图 PCR终止 PCR终止峰 终止峰后的噪音峰 PCR终止峰 噪音峰 一、插入或缺失 特征：从模板的插入或缺失位置开始出现双峰。 插入位点 二、结 构 PolyA/T一般会导致后续出现重叠峰 Poly在序列的前端对信号 影响较小 PolyG/C很容易导致 信号中断和信号衰减 ——————— ——————— 局部高GC一般会导致信号中断或乱峰 Poly-G也是高GC的一种 高GC含量导致信号衰减 三、峰图移码 1、引物问题： （1）新引物：合成时部分引物多了一个碱基或者少了一个碱基 （2）引物降解 2、结构导致移码（POLY结构，重复序列） 3、插入突变或缺失突变导致移码（部分突变） 缺失突变导致移码 引物问题引起的移码一般从峰图起始端就开始出现， 结构引发的移码是在结构之后才开始出现。 四、模板不纯 1、PCR有两套模板(非特异性条带) 2、盐离子等杂质干扰或两套模板大小相近会产生自始至终的双峰。 1、干扰峰（染料峰） 2、引物二聚体峰 3、宽峰，飘峰 4 、钉子峰 5、模板量高 染料峰 固定出现在70bp和110bp处 无信号峰型 无引物结合位点或没加模板 引物二聚体 解决方案：重跑或重测可以解决 但要注意是否是毛细管寿命问题 钉子峰 产生的原因：毛细管内有气泡，灰尘，和尿素结晶等。反射激光信号很高，且是全波长的，所以四色荧光并存。 * 影响酶活性 * 图来自ABI * 引物形成二聚体导致无信号