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SiRNA与RNAi实验技术手册 SiRNA与RNAi实验技术手册 RNA 是生物体内最重要的物质基础之一它与 DNA 和蛋白质一起构成生命的框架但长 久以来RNA 分子一直被认为是小角色然而一系列发现表明这些小分子 RNA 事实上 操纵着许多细胞功能它可通过互补序列的结合反作用于 DNA从而关闭或调节基因的表达 甚至某些小分子 RNA 可以通过指导基因的开关来调控细胞的发育时钟RNA 干涉 RNAi是 在线虫中发现的在 1998 年的一篇 Nature 论文中被公诸于众 此后科学家们还明白 RNAi 还有其他形式它既是一种了解基因功能的强大工具又是很多生物的基因组所采用 的一种在演化上来讲很古老的防卫方法 一什么是 siRNA 和 RNAi 双链 RNA 经酶切后会形成很多小片段称为 siRNA这些小片段一旦与信使 RNA mRNA 中的同源序列互补结合会导致 mRNA 失去功能即不能翻译产生蛋白质也就是使基因 沉 默了双链 RNA 对基因表达的阻断作用就被称为RNA 干预RNA interference RNAi 二RNAi 的作用机制是什么 目前 RNAi 的作用机理主要是在线虫果蝇斑马鱼等生物体内阐明的生物体内的双 链 RNA 可来 自于RNA 病毒感染转座子的转录产物外源导入的基因这些来源的双链 RNA 诱发了细胞内的 RNAi 机制结果是病毒被清除转座子的表达被阻断外源导入基因表达 被阻断同时与其同源的细胞基因组中的基因表达也被阻断 通过生化和遗传学研究表明RNA 干扰包括起始阶段和效应阶段 inititation and effector steps A在起始阶段加入的小分子 RNA 被切割为 21-23 核苷酸长的小分子干扰 RNA 片段 small interfering RNAs siRNAs 证据表明一个称为 Dicer 的酶是 RNase III 家族 中特异识别双链RNA 的一员它能以一种 ATP 依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因 病毒感染等各种方式引入的双链 RNA切割将 RNA 降解为 19-21bp 的双链 RNAs siRNAs 每 个片段的 3端都有 2 个碱基突出 热线电话021 －6485 8053 E-mailmastershinecom 网址comcn 技术部整理编辑 B在 RNAi 效应阶段siRNA 双链结合一个核酶复合物从而形成所谓 RNA 诱导沉默复合 物RNA-induced silencing complex RISC激活 RISC 需要一个 ATP 依赖的将小分子 RNA 解双链的过程激活的 RISC 通过碱基配对定位到同源 mRNA 转录本上并在距离 siRNA3 端 12 个碱基的位置切割mRNA尽管切割的确切机制尚不明了但每个 RISC 都包含一个 siRNA 和一个不同于 Dicer 的RNA 酶 另外还有研究证明含有启动子区的dsRNA在植物体内同样被切割成21-23nt长的片段 这种 dsRNA 可使内源相应的 DNA 序列甲基化从而使启动子失去功能使其下游基因沉默 三如何进行 RNAi 试验的设计 RNAi 研究的一般技术路线一般如下 由上述的路线可以看出获得高纯度的siRNA产物是进行实验的第一步而转染的 效率则是非常关键的因素 A设计siRNA序列 1 在设计RNAi实验时可以先在以下网站进行目标序列的筛选 httpcombusinessproductsorder2htm 热线电话021 －6485 8053 E-mailmastershinecom 网址comcn 技术部整理编辑 httpcomtechlibmiscsiRNA_finderhtml httpcomsbeduStushilinrnaihtml httpdecomrnadesigndefaultaspxSID 2RNAi目标序列的选取原则 1 从转录本 mRNA的AUG起始密码开始寻找AA二连序列并记下其 3端的 19 个 碱基序列作为潜在的siRNA靶位点有研究结果显示GC含量在 4555左右的siRNA要比 那些GC含量偏高的更为有效 Tuschl等建议在设计siRNA时不要针对 5和 3端的非编码区untranslated regions UTRs原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域而