钙依赖性酪氨酸激酶相关非激酶对心肌纤维化的防治分析-prevention and treatment of calcium-dependent tyrosine kinase-related non-kinases on myocardial fibrosis.docxVIP

钙依赖性酪氨酸激酶相关非激酶对心肌纤维化的防治研究摘要1. 背景与目的：心肌纤维化（myocardial fibrosis）是一种重要而常见的病理过程，它在心脏功能 从代偿到失代偿转变、心肌重塑从可逆到不可逆变化中发挥至关重要的作用。以基因 治疗手段防治心肌纤维化，靶点的选择和基因转移的方式是非常关键的。研究发现心 肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts，CFs)做为心肌间质纤维化的最终效应细胞，极有可 能成为心肌重塑和心力衰竭的新治疗靶细胞。在CFs中找到一个合适的信号网络交汇 点为靶点，可能对探索心肌间质纤维化防治措施具有重要意义和应用价值。钙依赖性 酪氨酸激酶(calcium-dependent proline-rich tyrosine kinase-2，Pyk2)在细胞内信号转导 中占有重要地位，且我们前期实验已经证实Pyk2在心肌纤维化过程中发挥着显著的 调节作用。钙依赖性酪氨酸激酶相关非激酶(Pyk2-related non-kinase，PRNK)是Pyk2 基因由于剪接不同所产生的一个单独表达c端结构域的同源蛋白，可能在特定的细胞 中选择性地调节着Pyk2的功能。基于以上背景资料，我们在实验中通过携带PRNK基因的腺病毒，从细胞模型和 动物模型两个层面初步观察腺病毒载体技术能否有效、稳定的将PRNK转移至靶细 胞；过表达PRNK是否可以有效的抑制Pyk2的磷酸化，从而减缓心肌纤维化的发展； 初步探讨将带有PRNK基因的腺病毒靶向抑制Pyk2作为防治心肌纤维化的基因治疗手 段之一的可能性，为深入研究Pyk2及PRNK对心肌纤维化的影响作用和分子机制提供 理论依据。方法首先通过全基因合成 PRNK 基因编码区 cDNA 并将其插入腺病毒载体，构建带 PRNK 基因的腺病毒基因组重组质粒；转染 293T 细胞进行包装与扩增、纯化；测定 病毒液滴度，行酶切鉴定，观察 293T 细胞的病变情况及荧光表达情况，Western blot 法鉴定 PRNK 是否高表达。然后将 PRNK 腺病毒载体转染以血管紧张素Ⅱ(angiotentionⅡ，AngⅡ)诱导的大 鼠心肌成纤维细胞。四唑盐比色法(MTT 法)及流式细胞仪测定 CFs 细胞增殖及凋亡变化，并以化学比色法及酶联免疫吸附测定法(ELISA 法)检测细胞培养上清中羟脯氨酸和Ⅰ型、Ⅳ型胶原分泌量的变化。Western blot 法检测 CFs 中 PRNK、磷酸化 Pyk2 的 蛋白表达。最后将大鼠制备腹主动脉狭窄模型，分成分为 4 组：假手术组 10 只；PRNK 腺病 毒载体干预组 10 只，造模的一周后尾静脉注射 PRNK 腺病毒载体 1ml；药物干预组 10 只，造模的一周后给予 PPARγ 激动剂罗格列酮 100 mg·kg-1·d-1，腹腔注射；手术组10 只，建立大鼠腹主动脉缩窄模型。术后 5 周，测定大鼠左室肥厚指数。心肌胶原 Van Gieson 染色后测量心肌组织胶原体积分数(collagen volume fraction，CVF)及心肌 血管周围胶原面积比例(perivascular collagen area，PVCA)；并通过心肌胶原 MASSON 法特殊染色分析蓝染胶原含量。TUNEL 法检测心肌组织中细胞凋亡变化。ELISA 法 检测心肌组织中Ⅰ型、Ⅳ型胶原分泌量的变化。Western blot 法分析导入基因后各组大 鼠心肌组织中 PRNK 及磷酸化 Pyk2 的蛋白表达。结果(1) 成功合成 PRNK 功能片段，并构建了含有此片段的腺病毒载体。该重组腺病 毒能使靶细胞有效表达 PRNK 蛋白。(2) PRNK 腺病毒载体能以较高感染效率感染体外培养大鼠心肌成纤维细胞并稳 定表达。(3)利用 PRNK 腺病毒载体感染 CFs 后，细胞培养上清中羟脯氨酸、Ⅰ型胶原、Ⅳ 型胶原检测值均明显低于对照组。MTT 比色 A 值和流式细胞仪检测显示 PRNK 可显 著抑制血管紧张素Ⅱ诱导下的 CFs 增殖，并促进其凋亡。(4)利用 PRNK 腺病毒载体感染 CFs 可高表达 PRNK，并可显著抑制由 AngⅡ引起 的 Pyk2 磷酸化。(5)将 PRNK 腺病毒载体经尾静脉导入大鼠心肌间质纤维化模型后，可引起 PRNK组大鼠心脏左心室重量/体重下降。(6) 将 PRNK 腺病毒载体经尾静脉导入大鼠心肌间质纤维化模型后，CVF 和 PVCA 测得值、蓝色胶原灰度均显著低于对照组。心肌成纤维细胞凋亡率显著高于对 照组。(7) PRNK 腺病毒载体经尾静脉导入大鼠心肌间质纤维化模型后，心肌组织羟脯 氨酸、Ⅰ型、Ⅳ型胶原检测明显低于对照组。(8) PRNK 腺病毒载体经尾静脉导入大鼠心肌间质纤维化模型后，大鼠心肌组织高表达 PRNK