中药浸出液及抗生素联用对耐药性细菌的抑菌作用研究讲解材料.pptVIP

中药浸出液及抗生素联用对耐药性 细菌的抑菌作用研究 讲解：石炎辉 PPT：施怿 组长：许耀豪 组员：梁倍源 梁昱娟 施怿 石炎辉 郑路 13级生物技术与应用基地班 2015.06.15 目录 1 简介 2 实验材料 3 实验方法与步骤 4 结果与讨论 1 简介  抗生素 中草药 耐药性细菌 2 实验材料 菌种与培养基 普通大肠杆菌为革兰氏阴性短杆菌，是人和动物肠道中的正常寄居菌，兼性厌氧，培养条件简单，对人类无剧烈危害； 氨苄抗性大肠杆菌对于氨苄抗生素具有抗性，在青霉素存在时仍然可以生存。 本实验使用的菌株为大肠杆菌top10，该菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。 2 实验材料 菌种与培养基 选用LB液体培养基用于扩增培养大肠杆菌：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl10g、去离子水1000ml、并且用NaOH调节该培养基的pH，使其达到7.4. 利用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基进行实验：牛肉膏5g、蛋白胨10g、NaCl5g、琼脂20g、水1000ml，调节该培养基的pH，使其达到7.0 3.1 制备中药浸出液 取五种干药材：金银花（1）、鱼腥草（2）、夏枯草（3）、藿香（4）、板蓝根（5）各50克，分别加入1L水煮沸，熬制至药汤颜色不再加深。 装入5个大锥形瓶中，依次贴标签1-5。 封口膜封口后高压蒸汽灭菌，冷却，放入冰箱中冷藏保存。 3.2 培养基配制 按照配方：每100mL水添加牛肉膏0.3g，蛋白胨1g，氯化钠0.5g，琼脂2g，调pH至7.0~7.2；配制牛肉膏蛋白胨培养基共2L，分装于大锥形瓶中，封口膜封口、高压蒸汽灭菌后备用，其中1L用于预实验，1L用于正式实验。 按照配方：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，调pH至7.4；配制LB培养基400mL分装于40支试管中，高压蒸汽灭菌后用于大肠杆菌的日常扩增培养。 3.3 制备无菌水 取10支洁净的试管，每支装水10mL，高压蒸汽灭菌后备用。 3.4 日常扩增培养 将取得的普通大肠杆菌、氨苄抗性大肠杆菌分别接种进2支LB培养基试管中，放入恒温培养箱扩增培养。 之后连续10天每天从前一天的4支试管中对应接种进新的4支LB培养基试管，以此保持菌种的持续扩增培养。 3.5 预实验 3.5.1 确定合适的氨苄抗生素浓度 用无菌水将氨苄抗生素药液在灭菌的Eppendorf管中稀释为原浓度的10-1、10-2、10-3。 将之前配制好的牛肉膏蛋白胨培养基在微波炉中化开，用无菌培养皿倒平板10个，作如下处理： 备注：具体处理方式为，用打孔器在滤纸片上打孔获得直径约为5mm的圆形小滤纸片，在酒精灯火焰附近灭菌后，蘸取相应的溶液并置于培养皿中央，每个培养皿中放置相应处理的纸片一片。 3.5 预实验 3.5.1 确定合适的氨苄抗生素浓度 处理好的10个培养皿置入恒温培养箱中培养，2天后取出观察，测量培养皿上形成抑菌环的直径（单位：cm），结果如下表： 由此确定合适的氨苄抗生素浓度为10-2。 3.5 预实验 3.5.2 确定合适的中药浓度 将五种中药药液分别用无菌水在Eppendorf管中稀释至原浓度的10-1、10-2。 将之前配置好的牛肉膏蛋白胨培养基在微波炉中化开，用无菌培养皿倒平板24个，分别作如下处理： 3.5 预实验 3.5.2 确定合适的中药浓度 处理好的24个培养皿置入恒温培养箱中培养，2天后取出观察，测量培养皿上由滤纸片边缘到抑菌圈边缘之间的距离，记为抑菌距离（单位：mm），结果如下表： 由此确定中药无需稀释，用原浓度进行正式实验。 3.6 正式实验 使用原浓度10-2的氨苄抗生素和原浓度的5种中药药液进行正式实验。 将之前配置好的牛肉膏蛋白胨培养基在微波炉中化开，用无菌培养皿倒平板24x2（共24种不同的处理方式，每种处理方式做2个平板）个，分别作如下处理： 3.6 正式实验 处理好的48个培养皿置入恒温培养箱中培养，2天后取出观察，测量培养皿上由滤纸片边缘到抑菌圈边缘之间的距离，记为抑菌距离（单位：mm），结果如下表（逗号隔开两个相同处理的平板获得的数据）： 3.7 数据分析与结论 多重比较是通过对总体均值之间的配对比较来进一步检验具体哪些均值之间存在差异。在这里，我们采用Fisher提出的最小显著差异方法，简写为LSD，该方法可用于判断到底哪些均值之间有差异。（＝0.05） 3.7 数据分析与结论 3.7.1 对普通菌进行多重比较分析 对普通菌所得到的数据进行多重比较分析，得下表（LSD=2.030907） 3.7 数据分析与结论 3.7.1 对普通菌进行多重比