氨基酸药物发酵生产.ppt

（3）工艺路线 （4）工艺过程 ①固定化氨基酰化酶的制备 取DEAE-Sephadex A-50（二乙氨基乙基葡聚糖,G后面的阿拉伯数为凝胶得水值的10倍。例如，G-25为每克凝胶膨胀时吸水2.5克）于去离子水中充分浸泡后，依次用10倍量0.5mol／L HCl和0.5mol／L NaOH溶液搅拌处理30min，再用去离子水洗至中性，然后依次用0.1mol／L及0.01mol／L的pH7.0磷酸缓冲液处理1～2h，滤干备用。 另取培养40～50h的米曲扩大曲用6倍量去离子水分两次抽提，滤去残渣。滤液用2mol／L NaOH溶液调pH6.7~7.0，按100L酶液加1kg已处理的湿DEAE-SephadexA-50的比例混合，于0～4℃搅拌吸附4～5h，滤取DEAE-Sephadex A-50，依次用去离子水、0.1mol／L醋酸钠、0.01mol／L的pH7.0磷酸缓冲液洗涤3～4次，滤干得固定化氨基酰化酶，加1％甲苯后于冷库中贮存，备用。 ②Ac-DL-Phe的制备 将DL-Phe、冰醋酸及醋酸酐按1∶7∶1（w／V／v）的比例加入反应釜中，90℃反应4～5h，回收醋酸，浓缩液加一定量去离子水，再浓缩至一定体积，冷却结晶，滤取结晶于60℃真空干燥得Ac－DL－Phe。 ③酶水解 在1000L反应罐中加700L 0.1mol／L Ac-DL-Phe钠盐溶液，搅拌下滴加6mol／L HCl至pH6.7～7.0，加15～20kg固定化氨基酰化酶，50℃反应4～5h，过滤，滤液待分离L－Phe，固定化酶再用于转化。 ④分离纯化 上述滤液用6mol／L HCl调至pH4.8～5.1，减压浓缩至35L左右，浓缩液于0℃结晶过夜，滤取结晶并用10L冷乙醇洗涤三次，抽干,于80℃烘3~4h，得L－Phe粗品。滤液和洗涤液合并后减压浓缩至20L左右，得Ac-D-Phe溶液，待消旋和再转化。 ⑤精制 取50L去离子水于100L反应罐中，加热至95~100℃，投入5kg L－Phe粗品，搅拌溶解，加药用活性炭0.25kg，搅拌脱色3min。趁热过滤，滤液转移至200L结晶罐中，冷却至40℃，加50 L 40℃ 95％乙醇，用6mol／L HCl调pH5.5，于0℃结晶过夜，滤取结晶，用10L冷乙醇洗涤3～4次，抽干，于80℃干燥3～4h。母液浓缩回收L-Phe结晶，所得结晶如上法重结晶一次，得药用L－Phe。结晶母液及洗涤液合并,减压浓缩后转入粗品母液，待消旋。 Ac－D－Phe的消旋 上述粗品及精品L-Phe母液及洗涤液合并后浓缩至60L,于100L反应罐中在搅拌下缓缓加入醋酸酐18.5L，在25～45℃搅拌反应30min，冷却至室温，放置6h，用浓盐酸调PH l.5～2.0，5℃结晶过夜，滤取结晶，用去离子水洗涤3～5次，每次20L，抽干，于40℃真空干燥得Ac－DL－Phe。 （5）检验 应为白色叶片状结晶，其含量应在98.5％～101.5％之间，〔α〕25D为-32.3°～+34.3°，1％水溶液pH为5.4～6.0，干燥失重应不超过0.3％，炽灼残渣应不超过0.4％，氯化物、硫酸盐及重金属均与异亮氨酸规定相同，砷盐应不超过1.5ppm，铁盐应不超过0.003%。 含量测定： （6）作用与用途 L-苯丙氨酸为复合氨基注射液的重要原料之一，也是合成苯丙氨酸 氮芥及对氟苯丙氨酸等抗癌药的原料。 四、化学合成法 ?（一）基本原理与过程 以α-卤代羧酸、醛类、甘氨酸衍生物、异氰酸盐、乙酰氨基丙二酸二乙酯、卤代烃、α-酮酸及某些氨基酸为原料，经氨解、水解、缩合、取代及氢化还原等化学反应合成α-氨基酸的方法称为化学合成法。 一般合成法和不对称合成法两大类。 一般合成法包括卤代酸水解法、氰胺水解法、乙酰氨基丙二酸二乙酯法、异氰酸酯（盐）合成法及醛缩合法等；产物皆为DL-型氨基酸混合物。 不对称合成法包括直接合成、α-酮酸反应及不对称催化加氢等方法。产物为L-型氨基酸。 （二）化学合成法生产的氨基酸品种及工艺 理论上所有氨基酸皆可由化学合成法制造，但在目前，只有当采用其它方法生产很不经济时才采用化学合成法生产，如甘氨酸、DL-蛋氨酸及DL-丙氨酸等 现仅介绍L-脯氨酸及L-苏氨酸的化学合成及其分离纯化工艺。 1、L-脯氨酸（L-Proline，L-Pro）的制备 （1）L-脯氨酸的结构与性质 L-脯氨酸存在于所有蛋白质中，鸡毛中含量较丰富。其化学名称为吡咯啶-α-甲酸或吡啶烷环-2-羧酸，分子式为C5H9NO2，分子量为115.13。 L-Pro自乙醇-乙醚中得白色粉末状结晶，pI为6.3，熔点220～222℃。极易溶于水，不溶于乙醇及