第一篇 章 分子克隆工具酶 基因工程 .ppt

1. Bal 31 核酸酶 分离自Alteromonas espejiana BAL31菌株 主要表现为3’端的核酸外切酶活性，同时伴有5’端外切及内切酶活性 上述活性严格依赖于Ca2+的存在，可在反应的不同阶段通过加入螯合剂EGTA以终止反应 主要用途是可控制性地截短DNA分子 2. 外切核酸酶III (ExoIII) 从双链DNA的3’-OH端逐一去除单核苷酸 对无Py、Pu位点的核酸内切酶活性 3’磷酸酶活性：去除3’端磷酸基(3’-P) RNaseH活性 主要用途是通过其3’→5’的外切酶活性使双链DNA分子产生出单链区 RNaseH活性 ExoIII的外切酶活性与RNaseH活性 ExoIII用于DNA标记 ExoIII 用于顺序缺失 3. λ外切核酸酶 （ λexo） 从单、双链DNA的5’-PO4基末端逐步切下5’-PO4 单核苷酸，不能降解 5’-OH端 主要用途是将双链DNA变为单链，供测序使用；除去5’-端突起，产生3’-端突起，便于加尾 4. S1核酸酶 特异性降解单链DNA和RNA，在最适条件下, 降解单链的速度比双链快75000倍 最佳pH 4.5 5. 核糖核酸酶 RNase A 分离自牛胰脏，特异性降解RNA 对热稳定（100℃加热15min仍具活性），抗去污剂 用于除去DNA样品中的RNA分子 6. RNase H 降解DNA-RNA杂交分子中的RNA链 用于cDNA文库建立时除去RNA链以便第二条链cDNA链的合成 7. 脱氧核糖核酸酶I (DNase I) 内切核酸酶，降解ss-和ds-DNA 当酶浓度很低时，ds -DNA分子上将形成切口 用途： 制备RNA样品时除去DNA分子 切口移位，制备DNA探针 E.coli DNA聚合酶 I Klenow 片段 T4 DNA 聚合酶 T7 DNA 聚合酶 Taq DNA 聚合酶 反转录酶…… 二、DNA聚合酶（DNA Polymerase） 1. 大肠杆菌DNA聚合酶I (E.coli DNA Pol I) E.coli 的DNA聚合酶系统 Pol I 参与DNA修复 Pol II 参与DNA修复 Pol III 参与DNA复制 E.coli DNA Pol I的3种酶活性 5’→3’ DNA聚合酶活性，要求3’-OH的引物和模板DNA 5’→3’ 核酸外切酶活性，具有双链特异性 3’→5’ 核酸外切酶活性，具有单链特异性，对ds-DNA的降解活性很低，是ss-DNA的过剩反应 用途： 除去3’-端突起的单链DNA（在无dNTP时） 补齐5’-突起端 合成第二条cDNA 切口移位制备探针 第一节 限制性内切酶 Restriction Enzymes Restriction Enzymes See movie An endonuclease（核酸内切酶） that recognizes specific nucleotide sequences in DNA and breaks the DNA chain at that sites 第一章 分子克隆工具酶 一、限制性内切酶的发现(The discovery of Restriction Enzymes) 1．细菌限制修饰系统 （ Restriction and Modification System of Bacteria) 2．限制性内切酶的发现 1968年，从E.coli K B中分离了I型限制性内切酶EcoK EcoB。 1970年，Smith和Wilox 首次从流感嗜血杆菌（H. influenzae）Rd菌株中发现并分离到HindII限制酶。 二、限制性内切酶的分类 I 型 ：识别特定序列，切割位点在距识别位点至少1000 bp处随机切割 EcoB：TGA(N)8TGCT, EcoK: AAC(N)6GTGC II 型：识别特定序列并在识别位点处或附近切割 III 型：识别特定序列，切割位点在距识别位点3’端25~27bp处随机切割 EcoP1：AGACC EcoP15：CAGCAG 三、限制性内切酶的命名 名称 属名 (大写、斜体) 种名 (小写、斜体) 菌株名 序数 来源菌株 EcoRI E co R I Escherichia coli R HindIII H in d III Haemophilus. Influenzae d HindII H in d II Haemophilus. Influenzae d HpaI H pa /