新 疆六种植原体病害检测与鉴定-detection and identification of plant diseases in xinjiang.docxVIP

石河子大学学位论文独创性声明及使用授权声明学位论文独创性声明本人所呈交的学位论文是在我导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果.据我所知，除 文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果.对本文的研究 做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明并表示谢意 .研究生签名 :在点乏时间 : J-;I俨 t !J J日使用授权声明本人完全了解石河子大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家主 管部门或指定机构送交论文的电子版和纸质版 .有权将学位论文在学校图书馆保存并允许被查阅. 有权自行或许可他人将学位论文编 入有关数据库提供检索服务 .有权将学位论文的标题和摘要汇编 出版.保密的学位论文在解密后适用本规定.研究生签名:导师签名 :和毛飞Qν-时间 :2P1 平 年 j 月 3 臼时间 : / (c!if -i.!J ? B摘 要本研究通过分子生物学方法检测和鉴定了新疆枣疯病、苦豆子丛枝病、新疆小叶白蜡丛枝病、 芦苇丛枝病、榆树丛枝病以及文冠果丛枝病等植原体病害病原。利用苯胺蓝和 4,6-二脒基-2-苯基吲 哚（DAPI）染色，在荧光显微镜下观察正常及发病新疆小叶白蜡和榆树的嫩茎横切片，进一步检测 验证患病植株中是否存在植原体。采用植原体 16S rRNA 基因通用引物对 P1/P7 和 R16F2n/R16R2，对以上六种植物正常及发病 植株总 DNA 进行直接和巢式 PCR 扩增，均得到约 1.2 kb 大小的特异性片段，测序得到的 16S rRNA 基因序列进行 blast 比对和邻接法构建系统进化树（MEGA 5.0, USA）显示, 该六种植原体均 与 16Sr V –B 亚组聚为一簇, 进化地位相同, 属于 16Sr V –B 亚组成员。RFLP 分析显示，实际 RFLP 与虚拟 RFLP 酶切结果一致，说明上述六种植原体同样均属于 16Sr V –B 亚组成员，该结果与构建系 统进化树相一致。采用植原体 tuf 基因序列的通用引物 fTufu／rTufu 对样品总 DNA 进行扩增，得到五条不同的 约 0.8 kb 大小的特异片段（文冠果丛枝病未扩增出）。通过核苷酸同源性比较和 MEGA 5.0 的邻接 法构建系统进化树分析结果显示，它们均与 16Sr V –B 亚组枣疯病植原体亲缘关系最近。该结果对 其 16S rRNA 基因分析结果一致。采用引物对 P1/P7 和 SR1/ SR2，对植原体 16S-23S rRNA 基因间区序列进行直接和巢式 PCR 扩增。新疆枣疯病和苦豆子丛枝病得到约 0.36 kb 大小的特异片段；新疆小叶白蜡丛枝病、芦苇丛 枝病、榆树丛枝病、以及文冠果丛枝病得到约 0.4 kb 大小的特异片段。核苷酸同源性比较显示，他 们之间的同源性在 94.1-99.4％，说明这六种病害是由不同的植原体菌株感染引起。以上六种植原体 属于 16Sr V –B 亚组的不同株系。苯胺蓝和 DAPI 染色后，在患病新疆小叶白蜡和榆树嫩茎横切面均出现特异性荧光条带或小点。 说明苯胺蓝和 DAPI 染色可用于新疆小叶白蜡丛枝病和榆树丛枝病植原体的检测。试验通过不同方法对新疆的六种植原体病害进行检测和鉴定，为这六种病害的防治提供技术支 持与理论依据。关键词：枣疯病；苦豆子丛枝病；新疆小叶白蜡丛枝病；芦苇丛枝病；榆树丛枝病；文冠果丛枝病； 植原体IAbstractJujube witches’ broom of Xinjiang, Sophora alopecuroides witches broom, Fraxinus sogdianaBunge witches broom, Phragmites australis witches’ broom, Elm witches’broom and Xanthoceras sorbifolia Bunge witches broom were detected and identified through molecular biology methods in this study. Another approaches to determine whether diseased plants harboured phytoplasma, horizontal slices of tender stem from Fraxinus sogdianaBunge and elm with and without symptoms were stained with aniline blue and 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), and then observed