八年级生物上册 第一章 动物的主要类群单元综合测试.pdfVIP

维普资讯 第 6卷第 3期 湖 北 职 业 技 术 学 院 学 报 No．3V0．1．6 2003年 9月 JournalofHubeiVocational——TechnicalCollege Sep． 2003 [文章编号]1671—8178(2003)03一o071—03 HBV核酸光敏生物素探针 的制备 李弘华 (湖北职业技术学院 护理系，湖北 孝感 432000) [摘 要]利用设计合成的特异性引物，通过PCR扩增获得 乙肝病毒的s区621个 bpDNA片段．该 扩增产物经 EcoRI与BamHl双酶切后直接克隆进入PSK载体进行表达，再通过扩增重组茵株，以获得大 量的s区DNA片段 ，对它们进行光敏生物素标记，制成探针，对 乙肝病毒进行检测灵敏度高，特异性强， 其灵敏度可达到4pg水平． [关键词]PCR扩增：BBV；DNA；克隆；光敏生物素标i5；核酸探针 [中图分类号]0789 [文献标识码]B 前 言 1、PCR扩增 乙型肝炎是 由乙型肝炎病毒 (hepatitiSB dNTP：TaqDNA聚合酶；Mgd2：10×buffer： virus，简称HBV)引起的一种世界性疾病。受HBV promege产品，引物 由武汉病毒所合成。 慢性感染的人群患原发性肝癌 (hepatocallular 引物以HBVadr亚型的基因组全序列为母序列 carcinoma·Hcc)的相对危险性至少增加 100倍 设计 。 … 。 因此加强对乙肝诊断和治疗的研究，建立和改 引物序列为： 进简便、快速、灵敏、特异的早期诊断技术和指示 P．(+) 5 GG从TTCATTGGGGACCCTGCG 3 共 乙肝愈合与转阴情况，以及评估慢性携带者的检验 22个碱基 13C／G 方法，仍是我国医学病毒学研究的重大课题。 p(一)5 GTCGGATCCATACCACATCATCC 3 共 目前，对 HBV检测通常使用的酶联免疫吸附实 24个碱基 12C／G 验 (ELISA)。它虽然能给我们提供较为准确的乙肝 PCR扩增总体积 20ul 免疫指标 (HBV．)，但存在一些缺点，如免疫交叉现 HBV DNA模板 2ul 象，周期长，灵敏度低等；核酸荧光探针作为核酸 10×反应 buffer 2ul· 标记工具，具有方便、快速、安全的特点 。，但荧 4种 dNTP各种 lul×4 0．2mmol／L 光背景，荧光强度受多方面因素影响。 引物 P(+)与 P(一) 3ulX2 0．5dmol／L 生物素标记的核酸探针技术是近几年发展起 TapDNA聚合酶 lul 60个单位几 来的一种非放射性标记技术。本实验主要采用光敏 双蒸水 5ul 生物素标记，这种方法对重组分子的检测灵敏度可 循环过程 ： · 达到4pg。本实验将就 HBVDNA的S区片段而制作 94℃ lmin~50℃ 2min一72℃ 3min循环 30 探针，并为探针制作提供一定的方法与实验依据。 次一72℃，保温 7min，反应 同步设阴性对照，取 材料与方法 2ul扩增产物酶切，lul载体缓冲液加水至 10ul， [收稿 日期]2o03—06—05 [作者简介]李弘华 (1973一 )，男，湖北监利人，湖北职业技术学院护理系助教，主要研究生物化学。 维普资讯