丹参酮ⅡA对人胃癌MKN45细胞增殖及基质金属.docVIP

　　丹参酮ⅡA对人胃癌MKN45细胞增殖及基质金属 【摘要】 目的］通过观察丹参酮ⅡA对人胃癌MKN45细胞的抑制作用及对转移相关基因MMP2表达的影响，探讨其抗肿瘤的机制。［方法］MTT法检测不同浓度丹参酮ⅡA作用下，体外培养的MKN45细胞的增殖情况； RTPCR法、酶谱分析法检测MKN45细胞MMP2 mRNA及蛋白的表达。［结果］丹参酮ⅡA各浓度组对肿瘤细胞增殖的抑制率与阴性对照组相比，有显著差异（Plt;0.05），相关回归分析表明24h、48h、72h的半数抑制浓度分别为42.5μg /ml、19.4μg /ml和7.4μg /ml。PCR半定量分析发现：丹参酮ⅡA各组的MMP2 mRNA表达均受到抑制，抑制程度随着药物浓度的增加而增加，酶谱分析法显示：丹参酮ⅡA能降低胃癌MKN45细胞的MMP2蛋白表达，其作用呈剂量效应正相关，与阴性对照组相比，差异有显著性（Plt;0.05）。［结论］丹参酮ⅡA能有效抑制胃癌MKN45细胞的生长，并具有明显的时间和剂量依赖性。丹参酮ⅡA可能通过抑制胃癌MKN45细胞MMP2 mRNA的转录下调MMP2蛋白的表达，进而抑制肿瘤增殖。 【关键词】 丹参酮ⅡA；胃癌；抑制率；基质金属蛋白酶2 　　Abstract：［Objective］ To determine the antitumor mechanism of TanshinoneⅡA on human Gastric Carcinoma Cell Line MKN45.［Methods］MKN45 cells RNA easured by RTPCR and Zymography.［Results］ The difference of inhibition rates（IR） on Cell Line MKN45 betRNA of TanshinoneⅡA groups（3,6,9,12μg/ml） l one.［Conclusions］ TanshinoneⅡA inhibits the groedependent manner,ay be realized through doa;inhibiting rates;matrix metalloproteinases2 　　丹参酮ⅡA是活血化瘀类中药丹参的有效成分之一，具有明显的抗炎、抗氧化、调节免疫的作用，现代医学关于丹参酮抗肿瘤活性的研究相当活跃。本文检测丹参酮ⅡA对人胃癌MKN45细胞增殖及基质金属蛋白酶2表达的影响，从分子生物学角度研究丹参酮ⅡA对胃癌的影响及机制。 　　1 材料与方法 　　1.1 肿瘤细胞株及培养条件 人胃癌MKN45细胞在含100u/ml青霉素、100u/ml链霉素、10%胎牛血清的RPMI1640培养液中，37℃、5% CO2条件下培养，取对数生长期细胞进行实验。 　　1.2 实验试剂及药物 丹参酮ⅡA纯品由中国药品生物制品鉴定所生产。引物根据Primer Premier 5.0软件设计，βactin上游引物：5’ATGCCATCCTGCGTCTG 3’，下游引物：5’GGACTCA TCGTACTCCTGCT3’；MMP2上游引物5’ ACCTGGATGCCGTCGTGGA C3’，下游引物：5’TGTGGCAGCACCAGGGCAGC3’。 　　1.3 实验方法 　　1.3.1 MTT法 指数生长期的MKN45细胞，按每孔1×104密度接种于96孔板，每孔补足RPMI1640培养液至200μl。另设只加培养液的阴性对照孔和阳性对照孔（顺铂2.5μg/ml）。过12h待细胞贴壁良好后，分别加入不同浓度丹参酮ⅡA干预，使终浓度为64μg/ml、32μg/ml、16μg/ml、8μg/ml、4μg/ml。每个浓度设5个复孔。于加药24h、48h、72h后分别取样终止培养，每孔加入5mg/ml MTT溶液20μl，37℃孵育4h，弃孔内上清液后加入二甲亚砜（DMSO）150μl，振荡10min。最后570nm波长下，酶标仪检测各孔吸光值，并减去空白对照组吸光值。细胞抑制率=（1－实验组吸光度值/对照组吸光度值）×100%。剂量和效应关系用直线回归分析和相关分析，结合对数机率单位法求 IC50。 　　1.3.2 RTPCR法 50ml的培养瓶中装10ml培养液培养人胃癌MKN45细胞，细胞浓度为9×104/ml，24h后，分别用3μg/ml、6μg/ml、9μg/ml、12 μg/ml丹参酮ⅡA处理，同时设阳性对照组（0.5μg/ml顺铂）和阴性对照组（0μg/ml），培养24h、48h后，Trizol法提取RNA，以βactin基因为内参用Taq DNA Polymerase（5u