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《细胞破碎技术》课件.pptVIP

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《细胞破碎技术》课件

研磨法 原理 最早在实验室用的研磨法是使用氧化铝,也可用细玻璃粉或石英粉作为研磨剂, 其颗粒大小为0.1 nm。先将细胞和研磨剂按1比5的比例混合均匀,预冷后放入研钵,手持研磨杵进行研磨。依靠在压力下推动固体与细胞的挤压与磨擦使细胞壁破碎。该法简便,但效率低,处理量小。只能在实验室中使用。根据这个原理,设计了细菌磨。 细菌磨结构示意图 主要由研磨和动力两部分构成。研磨部分包括滚筒和承座。滚筒是长15 cm,直径5 cm,厚度为2 nm以上的硬质磨砂玻璃管;承座是能与玻璃滚筒的半面密切贴合的凹型硬质瓷座。玻璃滚筒两端用橡皮塞密封,一端带有被动轮的钢轴通过橡皮塞中心贯穿玻璃滚筒,滚筒与瓷承座不但要密切吻合,且必须互相贴紧。因此,在瓷承座下必须垫以强有力的弹簧或富有弹性的橡胶。玻璃滚筒内可加入冰块,以便降温;瓷承坐也可制成中空的,接上进出口,可以通入冷却水,以便控制研磨细胞时的温度。 动力部分是一小马达,由皮带与被动轮传动,减速后,滚筒转速为120-130 r/min。 操作 将湿菌体与1.3-1.5倍重量的直径在3mm以下的玻璃粉研磨剂共置一研钵内,冷却至5℃以下,迅速将玻璃粉和湿细胞混合均匀,研压成块,用不锈钢勺取5 g左右的混合物,自旋转的滚筒前边加入并迅速挤压,使混合物随滚筒进入磨中,随即压挤附着在滚筒表面形成薄层,研磨20-30 sec,用一长方形玻璃片横置于滚筒面上,将研磨的混合物自滚筒上刮下。 研磨混合物中的水量极为重要,太少时混合物不能附着在滚筒上,太多时研磨破碎效率大幅度降低。因此,研磨混合物制备时的水量应根据细胞的干湿加以控制。破碎率可通过破碎时间加以掌握,一般也可达到95%以上的破碎率。 利用该法破碎细胞的效率低,它只适于实验室和小量制备。但其适用范围较广,可破碎细菌,酵母,真菌,甚至动植物组织。 干燥提取法 该法适合提取酵母中比较稳定的酶。通过干燥使细胞膜的渗透性改变,从而使细胞内某些物质容易抽提。 干燥的方法包括空气干燥、真空干燥、冷冻干燥和水溶性有机溶剂脱水干燥等。空气干燥一般是在25-30℃或高至35-40℃的干燥气流中吹干,将干细胞再悬浮在3-5倍的水或缓冲液中,室温下搅拌2-3 h抽提。抽提的缓冲液pH在8-9时比7.0时抽提的可溶性蛋白质较多;如果目的蛋白质稳定性较高,可在40-45℃下抽提;如果目的蛋白质不稳定,需在较低的温度下处理。一般来说, 空气干燥的细胞提取的蛋白质要比真空干燥和冷冻干燥的多,这是由于在空气干燥时细胞会发生自溶的原故。 在有机溶剂脱水干燥时使用的有机溶剂有丙酮及二氧六环。通常将十倍于细胞悬浮液的有机溶剂预冷至-20℃,在搅拌下将细胞悬浮液缓慢倒入有机溶剂,停止搅拌,静止使之自然沉降,倾去上清,用布氏漏斗真空过滤,滤饼用冷的有机溶剂洗涤,抽干后,立即放入内放有石蜡真空干燥器,吸附残余的有机溶剂。干燥的细胞可采用上述的抽提方法进行处理。由于有机溶剂将细胞膜上的脂类物质去除,改善了通透性,有利于酶的提取。 冻融法 此法是利用细胞含有大量水份,在快速冷冻时,细胞内水很快结晶,形成大量晶核,体积增大,将细胞胀破,达到破碎细胞的目的。 一般是将40-70%的细胞悬浮液放入低温冰箱使之快速冷冻,冻结后,取出在室温下融化,然后再冷冻,反复进行,通常需三次以上,酶的释放率才可能达到满意。 此法主要适用于大肠杆菌和细胞壁较薄的细菌,特别适用于位胞间质的酶的释放。 冻融法十分简便,不需特殊设备,在实验室中使用很方便,但耗时,耗能,大规模应用困难。 化学法 某些有机溶剂、表面活性剂、金属螯合剂、变性剂、抗生素等化学试剂可以改变细胞壁或膜结构的通透性,使胞内物质有选择性的渗透出来,因此,将这种处理方法统称为化学法。 有机溶剂法 使用非水溶性的有机溶剂,如醋酸乙酯、苯、甲苯、乙醚或氯仿处理使细胞脱脂,改变其渗透性,或使细胞自溶。例如甲苯能溶解细胞膜的磷脂层,改善膜的通透性。 由酵母细胞提取酶经常使用此法,将500 g酵母湿细胞与480 ml甲苯混合,于40℃下搅拌2 h,放置待温度降到10℃以下,加入1 L水或缓冲液,搅拌后,放入冷柜过夜,酶即释放到水相中。分出有机相,将水相离心除去细胞和不溶物,即可得粗酶溶液。 利用此法可以自溶的菌有无色杆菌、芽胞杆菌、梭菌、假单孢菌等,而

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