十植物脱毒技术.ppt

12、4通过茎尖培养消除病菌 1）原理及依据 病毒在植物体内分布不均，茎尖处含量最少 病毒DNA分子与细胞分裂蛋白质合成竞争 2）操作程序 外植体经表面消毒灭菌后，在解剖镜下，经无菌操作切取小茎尖，接种到备用培养基上，放入培养室内进行培养，并及时观察和记录培养结果。 第31页/共60页 12、4、1 外植体名称 在应用组织培养方法以获得无病菌植物时，所用的所用的外植体可以是茎尖，也可以是茎的顶端分生组织。在这里，顶端分生组织是指茎的最幼龄叶原基上方的一部分，最大直径约为100um，最大长度约为250um。 茎尖是由顶端分生组织及其下方的1-3个叶原基一起构成的（如图13、2），虽然通过顶端分生组织培养消除病毒的机会较高，但在大多数已发表的的工作中，无毒植物都市通过茎尖培养得到的。 第32页/共60页 12、4、2剥取茎尖的方法 解剖镜（体视显微镜），解剖针，解剖刀。为了防止茎尖变干，要在衬有无菌湿滤纸的培养皿内进行解剖。 茎尖外植体要用75％酒精浸蘸一下或0.1％的次氯酸钠消毒（10分钟）。 第33页/共60页 在剖取茎尖时，要把茎芽置于解剖镜下，一手用一把细镊子将其按住，另一手用解剖针将叶片和叶原基剥掉。当形似一个透明闪亮的半球形顶端分生组织暴露出来之后，用一个锋利的长柄刀片将分生组织切下来，上面可以带有叶原基，也可不带，然后用同一工具接种到培养基上。对于难以生根的要嫁接到健康的砧木上。 注意，不要太大，以免带有较老的组织。 第34页/共60页 1、茎尖脱毒方法 1）取样与消毒 可直接选定的植株上取顶芽进行消毒接种。采顶芽与侧芽消毒接种 。 消毒方法是：剪取顶芽梢段3、5厘米，剥去大叶片，用自来水冲洗干净，在75%酒精中浸泡30秒左右，用1%-3次氯酸钠或5%-7%的漂白粉溶液消毒10-20分，最后用无菌水冲洗材料4-5次。 第35页/共60页 酒精擦拭手 外植体消毒 浸泡5min 器械消毒 酒精灯灼烧 酒精擦拭培养皿 第36页/共60页 2、茎尖剥离和接种 将已消毒的芽放在带滤纸的培养皿上—器械固定—解剖镜下剥去幼叶—切下带1-2个叶原基的生长点（0.3-0.5mm）—切下的茎尖转至培养基上（顶部向上）。 第37页/共60页 酒精擦拭 旋转灼烧 显微镜下获取茎尖 接种 盖好瓶塞 第38页/共60页 脱毒马铃薯试管苗 第39页/共60页 3．培养 25+2℃ ，1500-5000LX，10-16h 一般光照培养比暗培养效果好。其间应更换新鲜培养基。提高培养基中BA的浓度可形成大量从生芽。4．生根诱导 诱导生根的方法是将2-3cm高的无根苗转入生根培养基继续培养1-2个月可生根。 第40页/共60页 12、4、3在茎尖中影响脱毒效果的因素 （一）培养基 MS培养基是常用的较好的适于茎尖培养的培养基之一。下表是几种常用于茎尖培养的培养基。 虽然较大的茎尖外植体（500μm）或更长在不含生长调节剂的培养基中也能产生一些完整的植株，但一般来说，含有少量（0.1－0.5mg/L的生长素或细胞分裂素或二者皆有常常是有利的。 在各种不同的生长素中，应当避免使用2，4－D，因为它通常能诱导外植体形成愈伤组织，广泛使用的生长素是NAA和IAA，其中NAA由于比较稳定，效果更好。 第41页/共60页 第42页/共60页 第43页/共60页 （二）外植体大小 在最适培养条件下，外植体的大小可以决定茎尖的存活率。外植体越大，产生再生植株的机会也就越多，在木薯中，只有200 μm长的外植体能够形成完整的植株，再小的茎尖或是形成愈伤组织，或是只能长根。小外植体可能也不利于茎的生根。然而，不应当离开脱毒效率（它与外植体的大小呈负相关）单独看待外植体的存活率，因此，外植体应小到足以能根除病毒，大到足以能发育成一个完整的植株。 第44页/共60页 用于脱毒的适宜茎尖大小 植物 病毒名称 剥离茎尖大小 （mm） 植物 病毒名称 剥离茎尖大小 （mm） 马铃薯 马铃薯卷叶病毒 1.0～3.0 百合 花叶病 0.2～1.0 马铃薯Y病毒 1.0～3.0 鸢尾 花叶病 0.2～0.5 马铃薯X病毒 0.2～0.5 菊花 各种病毒 0.2～1.0 马铃薯G病毒 0.2～0.3 康乃馨 各种病毒 0.2～0.8 马铃薯S病毒 0.2以下 大丽花 花叶病 0.6 甘薯 斑纹花叶病毒 1.0～2.0 大蒜 花叶病毒 0.3～1.0 缩叶花叶病毒 1.0～2.0 甘蔗 花叶病 0.7～3.0 羽