二张基因工程制药目基因分离.pptx

本节内容分离目的基因的方法及原理目的基因分离方法的选择原则目的基因的序列测定第一节 分离目的基因的方法及原理目的基因的定义： target gene 对基因组中某一基因成分或该基因片段进行研究 或应用，首先需要通过克隆、扩增以获得该基因， 此基因（或片段）称为目的基因。外源性基因（或DNA）： cloned DNA in vitro 插入至载体、并导入宿主细胞内复制的基因。1DNA重组技术： 按照人的意愿在体外对 DNA 分子进行重组， 再将重组分子导入受体细胞，使其在细胞中 扩增和繁殖，以获得该DNA分子的大量拷贝。目的基因的来源从庞大的基因群中获得某一目的基因的DNA 片段要求 ①纯度高；②数量多原核细胞（较易获得目的基因） 基因组较小，可直接分离获得 基因组 限制性内切酶 水解成若干 片段 探针筛选 提纯 扩增 真核生物：一个单拷贝基因仅占整个基因组的 10-5甚至更少，不易获得。真核细胞目的基因的来源根据不同要求选择 1. 构建 cDNA文库 2. 构建基因组文库 3. 人工合成Synthesize DNA in vitro 4. PCR扩增DNA文库：通过重组、克隆保存在宿主细胞中的各种DNA分子的集合体。文库保存了该种生物的全部遗传信息，需要时可从中分离获得。1. cDNA文库 ——只包括表达成蛋白质的DNA序列2. 基因组文库——代表该种生物体所有的DNA序列 cDNA (互补DNA,complementary DNA)分类: 用人特异性Alu序列扩增，寻找外显子，可以得到染色体段内表达基因的分布图区域特异性cDNA文库 从特定位点的基因组DNA出发寻找转录序列 即以含有某种人染色体或其区段的杂交细胞株分离RNA,反转录合成cDNA组织特异性cDNA文库 从cDNA出发寻找转录序列，将其定位于遗传图谱或物理图谱上。 即以不同发育阶段的人组织细胞为材料，提取RNA，构成cDNA文库。 可得到特定细胞的外显子图谱一、构建cDNA文库 cDNA以mRNA为模板经逆转录而成，故须选择mRNA丰富、较易获得的、目的基因表达活跃的组织细胞为材料。1.真核细胞mRNA的分离和纯化提取细胞内总RNA分离和纯化mRNA mRNA 3’端有polyA尾，用oligo-dT纤维 素亲和柱分离纯化mRNA。cDNA第一链合成2. 逆转录合成cDNAcDNA第一链合成的注意事项合成效率低cDNA长度应为0.7-8kb各种反转录酶只能存于-20℃，不可-70 ℃方法Ⅰ：①合成cDNA第一链 5’~~~~~~~~~~~~~~~~~~AAAAAA 3’ mRNA TTTTTTT 5’ cDNA 1 Oligo(dT)，反转录酶 d NTP, ②合成cDNA第二链 ~~~ ~~~ ~~~ AAAAAA 3’ cDNA 2 TTTTTTT 5’ RNase H，DNA聚合酶, dNTP 5’ AAAAAA 3’ 双链 cDNA 3’ TTTTTTT 5’Poly（T）引物反转录酶降解RNA发夹DNA聚合酶S1酶去除发夹cDNA第二链合成 方法：自身引导法 第一链合成过程中形成cDNA/RNA杂交分子变性，降解RNA单链cDNA分子的3’末端自身环化，形成发夹结构以此为引物，在DNA聚合酶作用下合成第二链 缺点：S1核酸酶置换合成法焦磷酸钠存在下合成cDNA的第一链RNAaseH酶降解RNARNA链上出现切口产生一系列带3’-OH的RNA引物大肠杆菌DNA聚合酶合成cDNA的第二链PCR法3.构建cDNA文库（1）修饰cDNA两端 接头：人工合成的双链寡核苷酸， 二端均为平头或含酶切位点。 衔接头：一端为平头，一端为粘末端。 （2）cDNA与载体相连 各cDNA各自与一个载体在T4连接酶 作用下以粘末端互相连接，即为重组DNA 分子。 （3）导入宿主细胞 重组体在一定条件下导入宿主细胞培 养或保存。 宿主细胞必须是来自一个细胞的克隆 体，以保证它们的遗传性状相同。4.筛选目的基因 核酸杂交法：cDNA克隆（菌斑或噬菌斑）硝酸纤维素膜杂交（DNA探针）显影定位挑选培养扩增纯化23二、构建基因组文库1. 分离纯化基因组DNA 条件应温和，以保证得到较长的DNA链2. DNA片段与载体连接 基因组DNA酶水解 具一定长度的片段 （粘性末端） 载体（噬菌体等） 酶解 与目的基因连接 3