酶学三重要酶类及其活性调.pptVIP

LDH同工酶谱分析的临床意义： LDH1：染色斑点大而深——帮助诊断心肌梗塞 LDH5：染色斑点大而深——帮助诊断肝癌 第31页/共48页 （一）酶分离纯化的一般原则—与蛋白质相似 1、选材：新鲜，含酶量高 2、破碎细胞：因材而已 3、抽提：低温，水或低盐溶液 4、分离纯化：粗分级及细分级 5、保存：低温 十、酶的研究方法与酶工程 第32页/共48页 1、酶活力（enzyme activity, 也称酶活性） （二）酶活力的测定方法 指酶催化一定化学反应的能力，用在一定条件下酶所催化反应的反应速度来表示。 2、酶活力单位（activit unit） 酶活力的大小用酶活力单位来表示，简称酶单位（unit, U），就是表示酶量多少的单位。其表示方法与所用的测定方法有关。 第33页/共48页 酶活力单位的表示方法 国际单位(IU)：1961年 在最适条件下，每分钟催化1μmol底物转化为产物所需的酶量为一个国际单位。 催量单位(katal)：1972年 指在最适条件下，每秒钟使１mol底物转化为产物所需的酶量为1Kat单位。 崔量单位与国际单位之间的关系：1Kat＝6×107IU ，可以用纳Kat、微Kat来进行换算。 第34页/共48页 3、酶的比活力(specific activity，也称比活性) 比活力：指每mg酶蛋白所具有的酶活力单位数，一般用U/mg蛋白质来表示。 比活力有时也可用每g或每ml酶制剂含多少个活力单位来表示。 比活力＝总活力单位数÷蛋白质总毫克数 ＝活力单位数÷mg蛋白质 (杂蛋白:包括酶蛋白及含非酶蛋白） ?比活力是衡量酶纯度的重要指标之一 第35页/共48页 4、测定酶活力时应注意几点 （1）应测反应的初速度 （2）酶的反应速度一般用单位时间内产物的增加量来表示。 （3）测酶活力时应使反应温度、pH、离子强度和底物浓度等因素保持恒定。 （4）测定酶反应速度时，应使[S][E]。 产 物 浓 度 [P] (t) 第36页/共48页 5、测定酶活力的一般方法 分光光度法 荧光法 酶偶联分析法 第37页/共48页 （1）分光光度法（spectrophotometry） 该法要求酶的底物和产物在紫外或可见光部分光吸收不同。 如氧化还原酶类。 简便、迅速、准确 一个样品可多次测定，有利于动力学研究 可检测到10-9mol/L水平的变化。 优点： 第38页/共48页 （2）荧光法（fluorometry）——放射测量法 该法要求酶反应的底物或产物有荧光变化。 主要优点：灵敏度高，可以检测10-12mol/L的样品 酶蛋白分子中的Tyr、Trp、Phe残基以及一些辅酶、辅基，如NADH NADPH、FMN、FAD等都能发出荧光。 例：乙醇 + NAD+ 乙醛 + NADH + H+ 乙醇脱氢酶 第39页/共48页 （3）酶偶联分析法(enzyme coupling assay) 第一个酶的产物为第二个酶的底物，这两个酶系统在一起反应。 P1无光吸收或荧光变化，偶联后, P2有光吸收或荧光变化。 第40页/共48页 酶的纯度鉴定： 聚丙烯酰胺凝胶电泳法 等电聚焦电泳法 第41页/共48页 酶工程（enzyme engineering）：是研究酶的生产和应用的一门技术性学科，是把酶学到基本原理、化学工程技术及基因重组技术有机结合在一起而形成的新型应用技术。 （三）酶工程（主要自学） 化学酶工程 生物酶工程 第42页/共48页 三、酶工程 酶工程：指酶制剂在工业上的大规模生产和应用。 1、化学酶工程： 由酶学与化学工程技术相结合而形成。 通过化学修饰、固定化处理、甚至化学 合成法等手段改善酶的性质，以提高催 化效率及降低成本。 五、酶学发展及动向 第43页/共48页 2、生物酶工程： 是在化学酶工程基础上发展起来的，是以酶学和DNA重组技术为主的现代分子生物学技术相结合的产物。包括： 1）用DNA重组技术大量生产酶； 2）对酶基因进行修饰，产生突变酶； 3）设计新的酶基因，合成自然界不曾有过的、性能稳定、催化效率更高的新酶。 五、酶学发展及动向 第44页/共48页 酶与某些疾病发生的关系 第45页/共48页 皮肤乳白色，毛发淡黄或银白色，瞳孔淡红，虹膜淡灰或淡红，半透明视网膜缺乏色素。 酪氨酸酶缺陷——白化病 第46页/共48