no在实验大鼠骨折愈合中作用机制研究.pdf

中文摘要 ／ 前 言 f ＼ 崤折愈合是一个使骨折碎片达到骨性连接的过程。骨折后骨 折断端由富含具有分化潜能的问质细胞和细胞因子的血肿所充 填，骨折断端完成骨痂连接一般经过软骨、骨化和重建三个阶段。 NO作为一种自由基气体，其在许多生物学活动中作为第二信使 而存在。NO在体内由基本氨基酸L一精氨酸合成，L一精氨酸反 应生成L一瓜氨酸和NO的过程由三种NO合酶催化(NOS)，其 中两个是少量基本存在的(eNOS和bNOS)，一个为大量诱生型的 ， (iNos)。 NO参与人体内许多器官的病理生理过程，其在骨科领域，包 括炎症、关节炎、骨愿疏松、无菌性松动，甚至在骨折愈合中作用的 研究正逐步深入oj本实验拟在骨折愈合过程中给予NOS的抑制 折后体内NO的合成和释放，通过研究不同时期骨折断端NOS的 表达和骨折愈合情况，进一步探讨NO在骨折愈合中的可能作用。 ／ 实验材料 ／ f ＼1．实验模型的建立： Wistar大鼠60只，随机分为三组，每组20只，分别为L—arg 物首先喂养以上饮用水一天，然后在0．1 g／Kg氯氨酮腹腔注射 麻醉后，建立股骨闭合骨折模型。 2．标本的取材 骨折模型建立后，在骨折后第3天、一周、二周以及四周分别 处死每组各5只大鼠，截取股骨中段骨痂组织及对侧未骨折之股 骨约1cm，置10％甲醛液中固定，至骨折后4周所有的骨折标本 取材后经用8mol／L甲酸+1 mol／L甲酸钠等量混合液中脱 钙1～2周，标本正中剖开，纵行切取包含骨折断端的骨痂，乙醇梯 度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。蜡块纵行切片，厚41J．m，分别行 HE染色及免疫组织化学法观察。 实验方法 1．HE染色及结果评价标准： 根据HE染色光镜下所见骨痂组织中纤维组织、软骨组织、编 织骨组织和成熟骨组织所含比例将骨折愈合程度分为10级，通过 观察实验组和对照组的骨痂中以上组织的级别均数来评价骨折的 愈合程度。 ’ 2．免疫组织化学法(SP法) 切片常规至脱蜡水化；3％过氧化氢浸泡来阻断内源性过氧化 物酶的活性；复合消化液消化20rain，血清封闭30min；滴加一抗 终止反应；苏木素复染3rain；l％盐酸酒精分化3秒；流水返蓝 15rain；脱水透明封片同前；各期间PBS液漂洗，光镜下观察NOS 的表达情况。 3．实验结果分析： 根据HE染色后各组标本光镜下所见愈合程度的均数作成配 对数据作表，采用t检验。(P值为与对照组比较后的结果) ·2· 实验结果 无论实验组还是对照组，未骨折处未见有NOS的表达，骨折 处也未见有bNOS的表达。iNOS和eNOS的表达情况略有不同： iNOS在骨折愈合各期都有表达(3天，1周，2周和4周)，而eNOS 在骨折愈合中的表达时期不同于iNOS(1周和2周)。并且它们 的表达强度也有所不同。NOS主要在成纤维细胞、成软骨细胞和 骨痂的血管内皮中表达。与对照组相比，L—NAME组的骨折愈 合程度要慢(P=0．10)，L—a唱组与之相比并没有显著差异；将两 个实验组比较，L—arg组的骨折愈合速度要强于L—NAME组 (P0．05)。 讨 论 NO是80年代逐渐被人们发现并认知的～种重要的信使分子 和效应分子。NO在多个系统的生理病理过程中所起的重要作用 不断被阐明，使NO的研究渗入到很多学科，成为生物医学领域的 热点和前沿之一。NO在临床上也得到初步应用，关于NO在心血 管、神经系统、肺部疾病、消化系统、器官移植以及骨关节疾病中作 用的研究越来越深入。 我们通过实验证实了在骨折愈合中骨折断端和骨痂中有 NOS的表达，说明在骨折时确实有NO产生，由此推断NO可能在 骨折愈合中起一定的作用。但是，关于NO在骨折中的作用机制 仍不十分