噬菌体在致病菌检测中应用.pdfVIP

摘要 摘要 致病菌的快速、灵敏检测将为食品安全、环境监测、疾病的诊断与治疗等 提供重要科学依据。建立在抗体特异性识别基础上的免疫分析方法是致病菌检 测最为常用的方法，然而特异性的单克隆抗体不仅价格昂贵，而且难以获取。 自然界中存在着各种各样的噬菌体，为细菌的特异检测提供了一个天然的宝库。 噬菌体能在活的具有感受性的菌体内繁殖，并且每种细菌基本都具有特异的噬 菌体。基于噬菌体的寄生专一性以及生长速度快等特点，噬菌体常被用来鉴定 一些特定的致病菌。 双砷染料是诺贝尔化学奖获得者钱永健实验室研发的一种适用于活细胞蛋 白标记的荧光探针，它是一类含有双砷基团的有机小分子(如FlAsH．EDT2)， 能够穿透细胞膜，与连在重组蛋白标记的六肽标签CCXXCC序列(简称四半 胱氨酸TC，其中X是除半胱氨酸外的任意氨基酸)发生特异性结合，生成强 荧光的共价结合的双砷染料．四半胱氨酸复合物(荧光强度约为FlAsH．EDT2的 50000倍)。与其它的蛋白荧光标记方法(如绿色荧光蛋白)相比较，四半胱氨 酸六肽标记序列体积小，不会影响被标记蛋白质或细胞的正常生理功能。此外， 双砷染料具有量子产率高、稳定性强、标记速度快并且能够提供除了荧光之外 的其它读出方式等优点，是一种更理想的蛋白质荧光探针。 本论文的第一章为绪论，首先对噬菌体在致病菌检测中的应用进行综述， 随后对课题研究的相关背景如噬茵体展示肽库技术、双砷染料．四半胱氨酸体系 进行介绍。 第二、三章主要介绍利用噬菌体对细菌的专一寄生性，建立噬菌体与双砷 染料．四半胱氨酸蛋白标记的联合运用体系，发展新型的致病菌快速鉴别诊断方 法。我们首先分别对噬菌体M13和T7进行基因改造，在其外壳上插入四半胱 氨酸序列(FLNCCPGCCMEP)。重组噬菌体侵染特异的宿主菌并在其体内快速 繁殖，噬菌体衣壳蛋白上所表达的四半胱氨酸序列与后续加入的跨膜双砷染料 共价结合，发出强烈的荧光信号，使细菌可在传统流式细胞仪、荧光显微镜上 进行检测，扩大了细菌的检测种类。 ‘ 第四章是结合噬菌体展示肽库技术，建立应用于致病菌检测的双功能噬菌 摘要 体探针构建实验技术平台。通过重叠延伸PCR定点法突变M13KE质粒的三个 位点，在pVIII基因区插入风，I和BamHI双酶切位点，在多克隆区删除AfI 片段，作为报告位点，在pIII衣壳蛋白中插入0157：H7的H7抗原的识别序列 ．LHI片段，作为捕获0157：H7的位点。尝试使用构建成功的双功能噬菌体作为 探针在传统流式细胞仪上检测O157：H7。 第五章是利用实验室自行研制的超高灵敏流式检测仪，发展噬菌体的绝对 计数方法。我们采用SYTOX Orange荧光染料对噬菌体T7和M13的DNA进 行染色，进而在双通道超高灵敏流式检测仪(HSFCM)上检测。HSFCM可以 检测到单个T7和M13的微弱荧光信号，实现了对T7噬菌体的绝对计数，实 验结果与传统的平板计数法有良好的对应关系。 本论文的主要成果是：l、建立了双砷染料．四半胱氨酸重组噬菌体体系， 对细菌进行特异性识别及信号放大，不仅可突破抗体难以获取的瓶颈，而且能 扩大细菌的检测种类；2、建立了应用于致病菌检测的双功能噬菌体构建实验技 术平台，为细菌检测中探针的设计合成拓宽了道路；3、充分发挥仪器优势，采 用课题组自行研制的双通道超高灵敏流式检测仪，发展了一种快速、灵敏的单 个噬菌体检测技术。 关键词噬菌体致病菌双砷染料．四半胱氨酸体系双功能噬菌体噬菌体计数 Ⅱ Abstract Abstract and of sensitivedetection bacteriaisvitaltoclinical Rapid pathogenic andfood diagnostics，environmental