双缩脲ml.ppt

生化技术实验 生物实验中心 2009.10 实验一 蛋白质含量测定--双缩脲法 一、 目的 学习掌握双缩脲法测定蛋白质含量。 了解其它一些蛋白质定量方法。 (BCA法、folin-酚试剂法，即lowry法，紫外分光光度法,280nm） 实验一 蛋白质含量测定--双缩脲法 实验一 蛋白质含量测定--双缩脲法 三、仪器与实验试剂 1、实验仪器 试管10ml（×7）/ 2人 不同刻度吸管若干支。 实验一 蛋白质含量测定--双缩脲法 三、仪器与实验试剂 2、实验试剂： 2.1、双缩脲试剂：取1.5g硫酸铜（CuSO4·5H2O）和6.0g酒石酸钾钠（NaKC4H406·4H2O）溶于500ml蒸馏水中，搅拌加入300ml的10% NaOH液（可另加1gKI以防止Cu离子自动还原成一价氧化亚铜沉淀），用水释至1000ml。此试剂可长期保存。若有黑色沉淀产生需重配。 （已配制好，可直接取用） 实验一 蛋白质含量测定--双缩脲法 三、仪器与实验试剂 2、实验试剂： 2.2 标准蛋白溶液：10mg/ml的酪蛋白溶液可用0.9%NaCl溶液配制 2.3 待测样品液：用酪蛋白配制 实验一 蛋白质含量测定--双缩脲法 四、实验操作方法 1．标准曲线的绘制 取干净试管6支，按0、1、2、3、4、5、6编号，按下表加入。各管加入试剂，充分混匀，即有紫红色出现，用540nm光测定各管A值，绘制C—A曲线。 实验一 蛋白质含量测定--双缩脲法 四、实验操作方法 2．样液测定 取未知浓度的蛋白液3.0ml置试管内，加入双缩尿试剂2.0ml，混匀，测其540nm的值，对照标准曲线方程，求得未知液蛋白浓度。 (注意：计算浓度时，不要把2ml双缩脲试剂计算在内，只能按3ml体积计算,测定液放置不能擦后果30分钟，防止出现沉淀) 实验一 蛋白质含量测定--双缩脲 实验报告： 1、简写出实验目的、原理 2、作出标准曲线图并得出标准曲线和相关系数。 3、计算未知蛋白液的浓度。 4、写出实验注意事项与讨论 （注意：一定要把原始数据填入原始数据栏） 实验二、植物多糖的提取、分离与鉴定 一. 实验目的 了解热水提取多糖的过程与注意事项。并了解目的物质提取过程中的主要影响因子及其相互关系。 掌握sevag试剂法除蛋白和乙醇沉降多糖的方法与注意事项。 并学会使用旋转蒸发仪分离浓缩目的物质。 二 .实验原理 用热水提取真菌植物子实体中的多糖,利用多糖类物质在热水中溶解度较高,将其提取出来。 利用sevag试剂将游离蛋白变性成为不溶性物质,经离心分离去除,可达到去除杂蛋白的目的 接着利用多糖在乙醇中溶解度降低的原理将多糖从溶液当中沉降出来。 三、 仪器 中低速离心机、循环真空泵、布式漏斗、高速干粉粉碎机、恒温水浴锅、旋转蒸发仪，可见分光光度计。250ml烧杯、试管、移液管若干、1000mL的磨口锥形瓶1个/组。 四、试剂 蒸馏水1000ml左右/组，平菇干燥粉末20克/组 0.1mg/mL的葡萄糖溶液15ml/组; 蒽酮试剂10ml/组，0.5mol/L NaOH10ml/组；5%苯酚体积15ml/组。 五、操作 1、平菇多糖的提取 取平菇干粉10克/每组，1000ml的的磨口锥形瓶中，按料液比15ml/克原料加入蒸馏水，轻轻摇匀。 将该装有原料液的锥形瓶放置于85℃的水浴锅中进行恒温萃取90min。萃取过程中，每隔15min左右轻轻摇晃锥形瓶。萃取完成后，将其放在离心管中，在4000r/min条件下离心15min，得到平菇多糖提取液。 五、操作 2、平菇多糖的分离纯化 在250ml分液漏斗中加入旋蒸仪中浓缩得到的25ml左右多糖提取液，然后按提取液：Sevag试剂[氯仿:正丁醇=2:1(v:v)的混合液]3:1的比例加入Sevag试剂。 混匀后于分液漏斗中振摇10min，用50ml离心管在3500r/min下离心然后静置到分层清晰,弃去下层有机相以及中间蛋白质与Sevag试剂生成的凝聚物, 得上清液。 五、操作 2、平菇多糖的分离纯化 将所得上清液，倒入250ml烧杯中，按多糖液体积：乙醇体积l:3的比例加入纯乙醇，在4℃冷藏条件下下沉降1h，待沉降完全后，将烧杯中的溶液放在离心管中，在4000r/min条件下离心15min，得到平菇多糖沉淀。 五 操作 3、平菇多糖的鉴定 离心得到的粗多糖充分溶解于50mL蒸馏水中，备用 3.1 多糖定性鉴定 3.1.1甲醇法:多糖样品配成lmg/ml水溶液，取lmL0.5mol/LNaOH，加入甲醇lml，出现白色混