电泳 十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS—PAGE)测定蛋白质的分子量.pptVIP

组成员：朱英帅、朱俊阳、卢刚、谭正 法库叶茂台辽墓墓址在辽宁法库县西南叶茂台村西该墓出土了纺织品、绘画、瓷器、漆器、铜器等很多类文物。其中，纺织品类文物经初步鉴定都是桑蚕丝组成，有绢、纱、罗、绮、锦和绒圈植物及缂丝等共七类九十余个品种规格。 叶茂台辽墓 由于这些珍贵织文物本身的有机材质决定了它不易保存，在考古发掘出土时就已很残破，因此，研究这批辽代丝织品的损害程度和损毁机理对于采取正确的保护方法具有十分重要的意义。 “电泳”，是指在凝胶(琼脂糖凝胶或十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)上用来推动或拉住分子的电动势；将待测分子放进凝胶上的井并导入适当的电流，分子就会以不同的速率在有孔隙的胶体中移动；如果分子带负电多就会往氧化极，带正电多就往还原极移动（注意到胶凝电泳操作原理相似于电解电池，氧化极带正电而还原极带负电）。 以蛋白质为例 蛋白质有不同的电荷和复杂的形状，所以当放电动势（EMF）在样品上，蛋白质可能会以不同的速度进入凝胶或完全不移动。所以蛋白质在有洗涤剂，如：十二烷基硫酸钠，SDS/十二烷基磷酸钠，SDP)）出现时会变性。洗涤剂会以负电荷覆盖蛋白质。通常 SDS 键结的量跟蛋白质的大小有关系，所以键结后变质的蛋白质带有负电荷，而且所有蛋白质有相似的“荷质比”（电荷和质量的比值）。因为变质的蛋白质移动方式像是长杆状，而不是复杂的三级结构，和SDS结合的蛋白质在凝胶内移动的速率只和它的大小有关，跟它的带电量或形状无关。 应用SDS—PAGE电泳技术分析古代丝绸降解后蚕丝分子量，对比现代蚕丝蛋白的分子量探讨其降解特征。由于蚕丝降解过程中涉及到丝蛋白结晶区域结构的变化，因此，利用x射线衍射技术进一步分析验证辽代蚕丝纤维结晶区域的降解情况。 辽宁法库叶茂台墓地出土的辽代丝绸 右图是现代蚕丝和辽代丝绸的SDS—PAGE电泳银染图，其中左边是现代蚕丝样品，右边是辽代丝绸样品，中间是标准蛋白。“-”代表的是丝绸样品没有加入蛋白酶，反之“+”代表的是样品中加入了蛋白酶。 现代蚕丝和辽代丝绸的SDS—PAGE图 为准确地计算电泳图中条带A、B、C、D的相对分子量，必须绘制标准蛋白质分子的对数(lgMr)一相对迁移率(Rm)之间的标准曲线。 标准蛋白对应的相对迁移率数据 根据lgMr—Rm标准曲线对条带A、B、C、D的相对分子量进行计算。 计算结果如下：辽代丝绸蛋白质中A条带对应的相对分子量65kD，B条带对应的相对分子量为56kD；现代蚕丝蛋白质c条带对应的相对分子量为28kD，D条带对应的相对分子量为25kD。 右图左边区域是现代蚕丝蛋白质电泳结果，可以看到两条相对分子量约为25kD的条带(分别记为C和D，箭头所示)，右边区域是辽代丝绸样品的电泳结果，可以看到在相对分子量为65kD附近存在两条带(分别记为A和B，箭头所示)。从右图可以看出无论是现代蚕丝样品还是辽代丝绸样品，加入了蛋白酶后在电泳图上没有条带出现，其原因在于蛋白酶酶解蛋白质，因此，由蛋白酶酶解蛋白质的结果可以证实法库叶茂台辽墓出土的纺织文物材料一定是蛋白质材料。 现代蚕丝和辽代丝绸的SDS—PAGE图 Tanaka认为蚕丝蛋白主要包括重链(390kD)和轻链(25kD)，两者之间以二硫键的形式连接在一起，同时还有一个分子量为约27kD的P25链与重链和轻链以非共价键相连，因此电泳结果出现的相对分子量为25kD多肽应该是蚕丝蛋白中的轻链，而27kD的多肽则为P25链。 辽代丝绸蛋白中不含有27kD和25kD肽链，说明是蚕丝蛋白中的轻链分解成分子量更小的肽链，或已经完全降解；辽代丝绸中出现的两条肽链其相对分子量介于25kD和390kD之间，而蚕丝中并不含有这样分子量大小的肽链，因此认为分子量为65kD和56kD两条肽段是相对分子量大于65kD的重链(390kD)断裂产物。 在蚕丝丝素中存在着结晶区、非结晶区以及过渡区一准结晶区，结晶区域肽链排列整齐、密集，非晶区肽链松散。重链既通过晶区又通过非晶区，而轻链只存在于非晶区中。蚕丝纤维的劣化首先是从非结晶区开始，这是因为非结晶区结构比较松散，分子间隙大，水、氧和金属离子等容易进入。 从分子水平分析蚕丝蛋白中轻链链段排列不整齐，因而受到外界因素的影响容易降解，而重链链段在分子构型上呈β一折叠链，链段与链段之间排列紧密，因而结晶区域处抵抗外界因素的能力较强，这就是在电泳结果中只残存着65kD和56kD肽链，而轻链25kD和P25肽链不存在的原因。 一般而言，丝素蛋白中存在silkⅠ和silk Ⅱ两种晶型．蚕丝纤维中丝素蛋白以silkⅡ形式存在。X一射线衍射网中衍射角2Θ为9.03度。的衍射峰为silk Ⅱ的特征线。 与现代蚕丝的x射线衍射结果相比，辽代丝绸在衍射角2θ为8.97度处的衍射峰更为明显。对XRD结果进行结晶度计算，数据显示现代