samiv核糖开关的结构与功能研究-study on the structure and function of samiv ribose switch.docxVIP

基础。本研究工作是基于“天蓝色链霉菌”（Streptomycescoelicolor,Sc），“金黄节杆菌”（Arthrobacteraurescens,Aau），“节杆菌”（Arthrobactersp.，Asp）等野生型菌株的SAM-IV基因结构进行优化设计，通过构建体外高效转录系统，经诱导转录获取转录本（SAM-IVRNA），再经分离纯化和回收获取高纯度样品，以备结晶测试之用。其次，基于SAM-IVRNA进行SHAPE分析。SHAPE分析结果显示，SAM的存在使SAM-IV的RNA二级，三级结构及预测的结合核心结构更加稳定，同时SAM的结合依赖于P5部分的参与。推测其存在SAM依赖性分子调控机制，从而为SAM-IV核酸开关调控机理研究奠定了基础。整体工作分为三部分，具体如下：SAMIVRNA制备与结晶首先，基于野生型SAM-IVRNA序列信息进行模板优化设计，其主要原则：1）保留核心功能区，剔除部分非功能区，并将部分非致死位碱基A，U突变为稳定性更高的碱基G，C；2）在构型两侧插入丁型肝炎病毒核酸酶（HDVribozyme）及锤头状核酶（Hammerheadribozyme）序列，以便于获取准确的目的片段。随后，由上海生工合成部代理合成优化模板序列，构建重组质粒。再经PCR扩增技术获取大量SAM-IV优化模板，进而利用构建好的体外转录体系经高效转录获取足量RNA，在转录体系中由于核酶的自剪切作用，将目的序列准确切下，经由变性尿素-聚丙烯酰胺凝胶（Urea）将产物分离纯化，通过胶回收后转入超滤离心管将目的样品进一步纯化，获得高纯转录本。而后将纯化所得RNA样本经IV重折叠后，由悬浮蒸汽扩散法（hangingdropvapordiffusionmethod）获得并筛选晶体。在实验中，初步测试了晶体条件，获得了部分SAM-IV晶体。SAM-IV结构优化及SHAPE分析根据不同种菌体的SAM-IV核糖开关设计不同的突变构型，并对用于SHAPE分析的核糖开关结构进行优化，以甄别各部分的功能及核糖开关作用机理。SAM-IVRNA准备同前，由生物公司合成并插入质粒，得到pUC57_SAM-IV_SHAPE模板，再经PCR、体外转录、胶分离纯化回收等步骤获得高纯样本RNA。最后通过SHAPE分析实验及测序仪分析得知SAM的存在使SAM-IVRNA折叠及整体三维结构更加稳定，同时精确定位了SAM-IVRNA与SAM的结合位点。而且还揭示了SAM的结合依赖于SAM-IV构型中P5部分的参与，推测其分子调节的机制跟P5部分有直接关系。3.体外转录体系优化优化体外转录体系，旨在高效获取RNA产物。体外转录被广泛用于分子生物学及结构生物学。鉴于一般转录RNA产量较低，故针对其部分条件进行优化，包括镁离子补加时间，镁离子补加浓度，NTP加入浓度，NTP补加浓度，反应总时间及无机焦磷酸酶等几个方面。实验中利用所掌握的资料及专业知识确定影响因素并设计正交实验，再通过方差分析，多重比较等方法得到了优化结果，即补加时间，Mg2+补加浓度，反应总时间，无机焦磷酸酶的添加等方面不对结果造成影响，属次要因素，NTP补加浓度为20mM/L，NTP加入浓度为25mM/LV时，RNA产量提升了300%。本课题旨在利用晶体测试及SHAPE分析对SAM-IV核糖开关的结构和功能进行研究。同时，还对体外转录体系进行优化，提升了RNA的产量。实验中通过优化SAM-IV核糖开关的结构，利用结晶测试获得了部分RNA晶体，且经SHAPE数据分析，得知SAM能够稳定SAM-IV的整体结构，并且准确定位了SAM-IV的SAM结合位点，同时发现P5在SAM的结合过程中有重要作用。并且经正交实验分析确定体外转录体系中当NTP补加浓度为20mM/L，NTP加入浓度为25mM/L时，RNA产量获得了3倍提升。这些研究为SAM-IV核糖开关的结构与机理有了进一步了解，加深人们对SAM核糖开关家族乃至核糖开关的认知。关键词：SAM-IV，核糖开关，体外转录，晶体学，SHAPEVITHESTRUCTUREANDFUNCTIONSTUDYOFTHESAM-IVRIBOSWITCHABSTRACTRiboswitchisanaturalRNAsensorandgeneregulator.Usually,itcanbindsmallmetabolitesdirectlyandthenrelaystructurechangestoregulategenes’expression.Manyresearchersbelievethatthismechanismistheoldestandtheprogressofcontrolgenes’expressiondoesnotneedpro-teindirectly