鳕鱼皮中流感病毒神经氨酸酶抑制活性肽的分析-analysis of neuraminidase inhibitory peptides of influenza virus in cod skin.docx

鳕鱼皮中流感病毒神经氨酸酶抑制活性肽的研究摘要神经氨酸酶（NA）是流感病毒表面重要的糖蛋白，在病毒的复制和传播过程中起重要作用。流感病毒容易产生变异，而NA活性位点高度保守，因此以NA为靶点的抗流感病毒药物成为了当前研究的热点。目前上市的NA抑制剂有扎那米韦和奥司他韦，而化学合成的药物成本高，价格贵，容易产生神经系统的不良反应以及其他的副反应，因此寻找天然抗病毒药物尤为重要。本实验以低值鳕鱼皮胶原蛋白为原料，探讨了其酶解液中活性肽的NA抑制活性，优化了酶解条件，经过分离纯化得到了高活性组分，鉴定了其结构，研究了其性质，并在细胞水平探讨了其抗病毒的作用方式。本文主要研究内容如下：1.采用不同的蛋白酶对鳕鱼皮胶原蛋白进行酶解，得到了具有流感病毒神经氨酸酶抑制活性的酶解物，在9种蛋白酶中筛选出胃蛋白酶为最佳水解用酶，其水解物的IC50值为8.86mg/mL。单因素实验分别考察了加酶量、底物浓度、酶解时间对酶解反应产物抑制活性的影响。利用响应面法优化了酶解条件，得到了利用鳕鱼皮胶原蛋白制备NA抑制活性肽的最佳条件为：加酶量1600U/g，底物浓度22mg/mL，酶解时间6.8h，优化条件后的酶解液IC50值为7.95mg/mL（P0.05）。用10mg/mL的粗酶解液进行细胞实验，得到的抑制率为66.6%，通过细胞病变抑制实验初步验证了酶解液的抗病毒活性。2.利用超滤、SephadexG-15凝胶柱层析、反相高效液相色谱等技术对NA抑制粗酶液进行了分离纯化，获得了一条具有NA抑制活性的多肽，鉴定其结构，并对其性质进行了研究。得到的氨基酸序列为PGEKGPSGEAGTAGPPGTPGPQGL。采用体外模拟胃肠道消化法，测定了不同阶段消化液对NA抑制活性的影响。研究发现活性肽不能抵制消化酶的作用，经过胃肠蛋白酶水解后，NA抑制活性显著降低，甚至失活，说明该活性肽不适合经口服用，需要考虑其他的途径摄入。抑制动力学实验显示，该活性肽为竞争性抑制剂，抑制常数Ki为0.29mmol/L。3.在细胞水平上对鳕鱼皮胶原蛋白多肽的抗流感病毒活性进行了研究。用MTT法测得NA抑制活性肽的最大无毒浓度为250μg/mL。在被感染的MDCK细胞上，活性肽对流感病毒有一定的抑制活性，一定浓度范围内，抗病毒效果与活性肽浓度成正相关，其半数抑制浓度IC50为471μg/mL。以三个不同作用方式（预处理，吸附同时，吸附后）对病毒进行处理，均有明显的抗病毒效果，说明活性肽不仅能降低病毒的毒力，而且能影响病毒与宿主细胞的吸附及其进入细胞后的复制和传播，说明鳕鱼皮多肽通过多种方式抗病毒。但是不同方式的抗病毒效果不同（P0.05），预处理组（138.7μg/mL）吸附时处理组（319.3μg/mL）吸附后处理组（417μg/mL），说明活性肽可能直接作用于病毒颗粒。在红细胞凝集实验中，随着活性肽的浓度增大，病毒的凝集价显著降低，说明NA抑制活性肽能显著影响HA的活性，也进一步证明了活性肽的抗病毒作用具有多靶点。关键词：鳕鱼皮；抗流感病毒活性肽；神经氨酸酶；分离纯化；细胞病变实验ThestudyofactivepeptidefromcodskinswithinfluenzavirusneuraminidaseinhibitoryactivityAbstractNeuraminidase(NA)isoneoftwoglycoproteinsexpressedonthevirussurface,anditisimportantforreplicationandspreadingoftheinfluenzavirus.Theyareeasytomutate,whiletheactivesiteofNAishighlyconservedacrossallinfluenzaAandBvirusstrains,soNAisanattractivetargetforananti-viralstrategyduetoitskeyrole.Sofar,zanamivirandoseltamivirasinhibitorsofNAhavebeenapprovedforhumanusebyFDA.However,thesedrugscancausenausea,vomitingandothersidereaction,whichhavebeenprovedtobethecase.So,searchingfornewantivivalcompoundsfromnaturalproductsisimportantforthedevelopmentofnewtherapeuticagents.Themaincontentsofthisstudywereasfollows:Thecollagenfromc