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2009年“临床诊断和治疗新进展研究’’暨“全国肿瘤病理诊断交流”研讨会 I型胶原蛋白基因在胃癌、食管癌中的表达 作者：刘勇攀 作者单位：江苏大学附属医院，江苏镇江212001 【捅要】[目的]应用荧光差异显示技术筛选胃癌中特异表达的基因，并验证其在胃癌、食管癌 中的表达，为进一步了解胃癌、食管癌发生、发展的分子机制提供帮助。[方法]应用荧光差异显 示技术(DD．PCR)分析胃癌及其相对应的正常胃黏膜组织，获得差异表达的基因片段，这些片段经 过二次PCR再扩增后进行克隆和测序，通过在GenBank中同源性检索，查找与差异片段相对应的同 源基因。应用半定量PCR，荧光定量PcR等方法进一步验证该基因在胃癌及食管癌中的表达差异。[结 果]通过DD-PCR得到的差异片段中的一个片段对应于人I型胶原蛋白基因。该基因的读码框长4 395bp，编码l464个氨基酸，编码蛋白分子量约139．01kD。该基因在胃癌及食管癌组织中的表达 量高于其对应的癌旁组织，并且在食管癌组织中的表达差异较胃癌中更明显。[结论]人I型胶原 蛋白基因在胃癌及食管癌中均呈高表达，推测其可能在胃癌及食管癌的发生发展中起作用。 【关键词】 基因I型胶原蛋白胃肿瘤食管肿瘤荧光差异显示聚合酶链反应分子生物学研 究表明癌基因、抑癌基因和细胞周期控制基因的异常表达参与了胃癌及其他恶性肿瘤的演进Eli。目 前许多胃癌特异表达基因已被鉴定及研究，如p53基因、谷胱甘肽S2转移酶基冈等，但胃癌发生、 发展的确切机制仍未阐明，因此寻找胃癌中新的特异表达的基冈对胃癌的基础研究与临床研究有重 要意义。本试验应用荧光差异显示方法(DD-PCR)筛选到胃癌中差异表达的I型胶原蛋白基因，并 利用mRNA定量分析方法检测该基冈在胃癌及食管癌组织中与其对应癌旁组织之间表达的差异。 1材料与方法 1．1临床材料 实验中标本来自2006年3月至2006年6月间于江苏大学附属医院接受手术治疗的胃癌患者12 例及食管癌患者14例。每例患者均取手术切除的癌组织及癌旁组织(距离癌组织约2’3era)，并经 病理检杏证实。组织离体后立即在液氮中速冻，并置于-70℃冰箱中保存。 1．2试剂和仪器 SuperScript FMBIO?静II(HITACHI)荧光差异显示系统，STRATAGENE (HITACHI)。 1．3cDNA的制备 的浓度，经DNase消化后，反转录得剑胃癌、食管癌及其癌旁组织的cDNA。 1．4DD-PCR 示PCR(DD—PCR)，PCR产物8II1上样于6％的聚丙烯酰胺凝胶，l400V恒压电泳5h左右。 1．5差异片克隆段的 筹异条带经切割和处理后作为模板，进行二次PcR，将产物连接于T载体。连接产物转化大肠 杆菌Dtt5a，蓝白斑筛选冈l性克隆。阳性克隆经酶切鉴定后测序(上海生工)。 1．6荧光定量PCR分析 胶原蛋白I型基冈在胃癌、食管癌组织及其癌旁组织中表达的差异。引物序列为：胶原蛋白I型基 冈：5-GAGAGCATGACCGATGGAT，3’一ATGTTTTGGTGGT- TCAGGAGG；内参B—actin：5’一GAGACCTT 式计算基冈相对拷贝数，利用SPSSl3．0软件对获得的数据进行分析。 129 2009年“临床诊断和治疗新进展研究”暨“全国肿瘤病理诊断交流”研讨会 1．7半定量PCR分析 为了对荧光定量PCR的结果进一步检验，用做定量PCR的两对引物对不同模板eDNA分别作了半 定量PCR，反应条件为94℃30s，57℃30s，72℃35s25个循环。通过凝胶成像系统软件对所得 电泳条带进行亮度和面积的分析，得出数据，然后用SPSSl3．0软件处理，得到直观的图象。 2结果 2．1阳性差异片段的筛选 聚丙烯酰胺凝胶电泳结果发现，胃癌组织和癌旁组织中基因的表达存在差异性。为进一步了解 这些差异片段的信息，将差异片段切出后，进行二次扩增，并对扩增到的片段进行克隆和序列分析。 原蛋白基因同源性达到100％(GenBank：Bc036531)。 2．2半定量PCR分析 本研究中取4例胃癌、3例食管癌标本对人I型胶原蛋白基因在癌组织及相应癌旁组织中的表 达量进行半定量分析。由图1、图2可看到人I型胶原蛋白基因在胃癌及食管癌组织及其癌旁组织 中均有表达，但在癌中的表达量高于旁组织，并且食管癌组织中的表达差异比胃癌中更明显。通过 凝胶成像