gdf9 dnmt1 zar1 mater基因在绵羊卵母细胞 卵丘细胞和胚胎中的表达研究-expression of gd f9 dnm t1 za r1 mate gene in sheep oocyte cumulus cells and embryos.docx

独 创 性 声 明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中 不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得新疆农业大 学或其他教育单位的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对 本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：时间：年月日关于学位论文使用授权的说明本人完全了解新疆农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：新 疆农业大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子文 档，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，允许论 文被查阅和借阅。本人授权新疆农业大学将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以公布(包括刊登)论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：时间：年月日导师签名：时间：年月日第 1 章绪论1.1研究目的与意义哺乳动物卵母细胞的体外成熟(invitro maturation，IVM)是一个复杂且有序的过程， 可分为三个层次：一是恢复和完成减数分裂到第二次减数分裂中期以排出第一极体为 标记的细胞核成熟[1]；二是细胞质成熟；三是获得正确基因组印迹的基因成熟[2]。而哺 乳动物卵母细胞体外成熟的质量对卵母细胞的成熟、受精及胚胎发育有着十分重要的 影响。动物体外受精、体外胚胎生产和克隆成功进行的关键是得到高质量的体外成熟卵 母细胞。卵母细胞细胞核成熟能够在体外正常的完成，但卵母细胞受精后的胚胎发育 能力却很差。一些研究证明，体外成熟牛卵母细胞受精后，其着床前胚胎发育能力显 著低于体内成熟卵母细胞受精后的胚胎发育能力[3]，这可能是由于体外培养的卵母细胞 胞质成熟不充分造成的[4]。卵母细胞的成熟是涉及核、质、膜、卵丘细胞和透明带等成 熟的一个复杂的、动态的生物学过程[5]。另外，在卵母细胞成熟过程中有许多代谢事件 发生，除了进行积极的 mRNA 转录、蛋白质合成外，还有其它一些物质的降解[6]。卵母细胞质量的好坏直接影响到家畜卵母细胞体外成熟、受精、培养以及单精子 注射、胚胎移植和动物克隆等现代辅助生殖技术的生产效率。目前，对家畜卵母细胞 质量鉴定的方法主要是基于形态学的观察，但是这种方法只能观察到卵母细胞中超微 结构的变化，不能鉴别出卵母细胞内部的胞质中的生理生化变化。因此，卵母细胞发 育能力需要更深层次的判断。本试验以不同时期、不同培养方式的绵羊卵母细胞、卵丘细胞、早期胚胎为研究 对象，检测生长分化因子 Gdf9 和母源基因 Zar1、Mater、Dnmt1 在各细胞组中的表达 水平。探讨了卵母细胞和早期胚胎发育过程中基因的动态水平变化，为哺乳动物卵母 细胞成熟和早期胚胎发育分子机理的研究提供参考，对卵母细胞生长、胚胎发育有重 要意义。研究 Gdf9、Zar1、Mater、Dnmt1 基因 mRNA 与卵母细胞质量的相关性，在分子水平上，检测所选基因是否能成为衡量卵母细胞质量的分子标识，为判断卵母细胞质量开辟了一个新的途径。此外，还对卵丘细胞与卵母细胞互相作用的分子机理进 行了研究。1.2卵母细胞成熟通常，卵母细胞成熟包括恢复减数分裂并进行至第二次减数分裂中期的核成熟和 胞质成熟[7]。细胞核成熟卵原细胞经过细线期、偶线期、粗线期、双线期等一系列有丝分裂进程，此期间 细胞核成泡状，故称为发生泡。一般来说，发生泡破裂(germinal vesicle break down， GVBD)、核仁消失、第一极体的排出是判断细胞核成熟的标志。细胞质成熟在卵母细胞减数分裂的成熟过程中，细胞核发生了相应的变化。如使卵母细胞具 备进行受精及胚胎阶段生长发育的能力，细胞质也必须发生某些相应的改变。在哺乳 动物卵母细胞成熟和受精过程中，核成熟过程伴随着胞质中一些重要遗传物质和细胞 器运动协调共同发生，这些事件能确保胚胎发育的正常进行[8]。卵母细胞的胞质成熟不仅有细胞器超微结构的改变，而且还发生了一系列复杂的 生理生化变化，但缺乏直观的标记[9]。细胞质成熟的过程中，许多超微结构都发生了相 应的变化。例如，卵母细胞成熟过程中皮质颗粒迁移及在皮质区的重新分布作为判断 卵母细胞胞质成熟的一个很好的指标为越来越多的研究者所接受[10-12]，当皮质颗粒位于 卵母细胞皮质下则为胞质成熟[13] 。透明带的也与卵母细胞成熟有关，透明带上的精子 受体 ZP1、ZP2、ZP3 发生重排，透明带外层呈网状，其内层附着有已断裂的微绒毛和 卵丘细胞的胞质的突起，同时透明带变软[14]，标志卵母细胞逐渐成熟。对许多哺乳动 物如绵羊、牛、仓鼠和猪等卵母细胞体外成熟及早期胚胎发育的研究表明，初级卵泡 阶段线粒体主要分布于核周围[15-18]。卵母细胞成熟后，线粒体由