不同时间运动骨骼肌AMPATP比值及AMPK活性变化特点.docVIP

不同时间运动骨骼肌AMPATP比值及AMPK活性变化特点 　　摘要：目的：研究不同时间一次性运动大鼠腓肠肌AMP、ATP含量及AMPK活性，旨在阐明不同时间运动AMPK的变化特点及机制。方法：62只雄性SD大鼠分为4大组：安静对照组（n=8）、30 min运动组（n=18）、60 min运动组（n=18）、90 min运动组（n=18），其中运动组又各分为3小组（n=6），分别在运动后即刻、1 h和6 h取材。运动速度18 m/min，坡度10%。结果：和安静组相比，各组ATP运动后无显著改变；AMP在60和90 min运动后即刻显著升高（0.183，0.212 Vs 0.158，P 　　关键词：AMPK；AMP/ATP比值；运动时间；骨骼肌? 　　中图分类号：G804.2文献标识码：A文章编号：1007-3612(2008)06-0776-03? 　　 　　5′-一磷酸腺苷激活的蛋白激酶（5′-AMP activated protein kinase , AMPK）称为细胞能量感受器，对运动骨骼肌能量代谢发挥着重要调控作用［1-2］。本实验研究不同时间运动AMP/ATP比值的变化特点及与AMPK活性的关系，探讨AMPK活性变化的分子机制。实验假设运动能以时间依赖方式激活骨骼肌AMPK，其机制与AMP/ATP比值的升高有关。 　　? 　　1材料与方法 　　 　　??1.1动物分组?62只8周龄健康雄性SD大鼠，购进时平均体重(187±14)g，由北京大学医学部实验动物中心提供。昼夜节律人工控制光照（光照时间为07：00-19：00），环境温度(23±2)℃，自由饮食。? 　　大鼠随机分为4大组：安静对照组（n=8）、30 min运动组(n=18)、60 min运动组(n=18)、90 min运动组(n=18)。除安静组外，其余各组又分为3个小组，每小组各6只，分别在运动后即刻(0 h)、1 h、6 h取材。取材前动物用乌拉坦腹腔麻醉（0.8 mL/100 g体重）后，速取右后肢腓肠肌的白肌部分（位于腓肠肌外侧浅层）投入液氮中保存。? 　　 　　1.2运动方案?运动动物先进行6 d适应性训练，方法如下：前三天分别以10 m/min、15 m/min、20 m/min的强度和10 min、20 min、30 min的时间进行递增负荷和时间跑台运动，后3 d固定于20 m/min的强度和30 min的时间进行运动，坡度均为10%，每天一次，在上午9:00-10:00进行，周日休息。适应性训练结束后，动物进行一次性运动。速度18 m/min，坡度10%，相当于65%V?O?2max强度，时间分别为30、60、90 min。 　　?1.3测试方法AMP、ATP含量测定使用高效液相??谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）。样品前处理过程：称取肌组织100 mg，剪碎后加入0.9% NaCl（内含0.5 mM EDTA-2Na）制成10%匀浆液，取0.5 mL匀浆液加入0.5 mL 3% HClO?4，4℃下沉淀蛋白，3 000转/min4℃离心10 min，取上清液0.5 mL加入20% KOH 40 μL， 4℃静置30 min，11 000转/分5 min离心，取上清200 μL -80℃保存待测。色谱条件为：日本Dikma公司ODS-3反相柱(250×4.6 mm) ，流动相为50 mmo1/L磷酸钾缓冲液，调pH至6.5，等比洗脱，流速为1.2 mL/min，检测波长254 nm，柱温20℃，进样量20 μL。? 　　AMPK活性的测定采用放射性同位素方法。即根据AMPK使特异性肽底物SAMS（氨基酸序列为HMRSAMSGLHLVKRR）磷酸化的原理，以［γ-32P］ATP作为磷供体检测酶的活性。按照Shin Terada［3］和Seung Hun Cha［4］提供的方法进行。AMPK活力单位： 30℃条件下，每分钟将1 nmol磷催化转入SAMS的酶量即1个单位酶活。 　　?1.4统计处理数据分析均采用SPSS13.0统计软件进行。计量资料用均数±标准差（X±SD）表示。计量资料的组间比较采用单因素方差分析，显著性水平取P 　　实验对调控AMPK活性的主要分子机制AMP/ATP比值在不同时间中的变化同步进行了研究。三组ATP在运动后即刻均无显著下降。AMP在30 min运动无显著增加，60和90 min运动出现显著性增加，相应地，AMP/ATP比值在运动后60和90 min有显著升高。对不同时间运动AMPK与AMPATP比值相关分析发现，运动后即刻呈显著正相关（r=0.67）。以上结果表明不同时间运动AMPK的激活主要由A