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高效液相色谱讲义 HPLC原理与仪器 HPLC分离机制与色谱柱 HPLC的方法开发 HPLC定性与定量方法 HPLC实用技术 Section 1液相色谱原理与仪器Theory and Instrument 常见的分离方式 蒸馏 离心 电泳（凝胶电泳，毛细管电泳） 过滤 超滤 色谱 色谱法的分类 HPLC的特点 高压 高效 高速 高灵敏 问题: HPLC为何会产生高压？高压和高效 间有何关系？ 第二节 色谱基础理论 一. 分配系数 K 分配系数 K的讨论 2、容量因子与分配系数 2、容量因子的计算 容量因子越大，保留时间越长。 可由保留时间计算出容量因子，两者有以下关系： 影响容量因子的因素与影响分配系数的因素相同，外加相比因素。 两个组份要实现分离的前提条件是： K(A)=K(B) 或 k(A)=k(B) 1. 色谱分离过程 2.塔板数和塔板高度 塔板数和塔板高度 3.塔板理论的要点： 三、 速率理论-影响柱效的因素 2. 涡流扩散项－A 3. 分子扩散项B/U—B分子扩散系数 4.传质阻力项Cu—传质阻力系数C 速率理论（与GC对比） 图示 续前 2）传质阻力项及其影响 图示 back 5. 填料颗粒直径对柱效的影响Effect of particle size on the column efficiency Van Deemter Equation of LC: 可见，dp对LC塔板高度有重要影响， 较小的dp有利于H的降低，提高柱效。目前HPLC填料的dp大约为2-10um.因此必定产生较高的柱压。 流动相流速及填料粒径对柱效的影响Effect of mobile phase velocity of the column efficiency 6. 速率理论的要点 四、 分离度（Resolution) 2. 分离度定义式 3. 色谱分离基本方程式 规律：? 塔板理论和速率理论都难以描述难分离物质对的实际分离程度。即柱效为多大时，相邻两组份能够被完全分离。? 难分离物质对的分离度大小受色谱过程中两种因素的综合影响： 保留值之差──选择性——色谱过程的热力学因素； 区域宽度──柱效——色谱过程的动力学因素。? 提高 n 和 ? 是提高分离度的有效途径? k的范围 1 k 10 4.影响分辨率的因素：K’，a，N 分辨率的方程∶ k 是容量因子，表达了样品与柱填料的作用强弱。 a 是选择性系数，描述两化合物分离的好坏程度。是化学因素。 N 是理论塔板数，描述色谱峰的谱带展宽程度。 提高柱效的方法 色谱柱本身 减小填料的颗粒度 找到最佳的流速(根据不同内径) 合适的温度 降低溶剂的粘度 增加柱长 其他影响柱效的因素 柱外效应 连接管路 进样器、检测器 进样体积 进样量 容量因子 k 改变k值的方法∶ 调节流动相的极性、pH、离子强度等 梯度淋洗 选择性系数 a 定义∶ a =1 时两组分分不开， 改变a的途径 改变固定相 改变流动相 改变温度 改变样品的本身性质 a ，k，N∶如何控制分辨率? 第三节 HPLC 仪器 1.LC，HPLC，UPLC，Nano-LC 2. HPLC与GC差别 相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测 主要差别：分析对象的差别和流动相的差别 分析对象 GC： 能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品， 高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及 高聚物的样品不可检测 占有机物的20% HPLC：溶解后能制成溶液的样品，不受样品挥发性和 热稳定性的限制 ，分子量大、难气化、热稳定 性差及高分子 和离子型样品均可检测 。 用途广泛，占有机物的80% 续前 流动相差别 GC：流动相为惰性气体 组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用 HPLC：流动相为液体 流动相与组分间有亲合作用力 HPLC的这一特点为提高柱的选择性、改善分离度增加了因素，对分离起很大作用。 流动相种类较多，选择余地广 流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 可以增大分离选择性 操作条件差别 GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小） 二、HPLC仪器 典型的仪器配置 HPLC 仪器系统 Solvent Reservoir and