固表解毒合剂对甲型流感病毒抑制作用实验研究.docVIP

固表解毒合剂对甲型流感病毒抑制作用实验研究 　　摘要：目的：研究固表解毒合剂体外抗病毒作用。方法：采用细胞培养法和鸡胚法，观察固表解毒合剂对甲型流感病毒的抑制作用，并与其他处方为对照。结果：固表解毒合剂对MDCK细胞和鸡胚的毒性小；当药物浓度为0.045g/mL时可保护50％细胞不产生病变，药物浓度为0.056g/mL时可保护50％鸡胚不受感染。结论：固表解毒合剂对甲型流感病毒具有抑制作用，其抑制作用比其他处方强。 　　关键词：固表解毒合剂；甲型流感病毒；抑制作用 　　中图分类号：R-33 　　文献标识码：A 　文章编号：1673-7717(2007)12-2536-02 　　 　　固表解毒合剂是2003年初“非典”流行的过程中，本院杜建教授根据温病理论，结合南方地理气候特点，自拟的预防方剂。该方由生黄芪、金银花、鱼腥草、生甘草4味药物组成，具有益气固表、清热解毒、疏散风热之效。临床实际应用结果表明，本???作为南方地区预防传染性疾病的方药是合理的。 　　本实验采用细胞培养法和鸡胚法从抗病毒角度研究固表解毒合剂对甲型流感病毒感染的MDCK细胞和鸡胚的保护作用，并且以国家中医药管理局推荐的处方2和处方5为对照，能够为本方的进一步开发应用以及中药防治病毒感染性疾病的机理提供实验依据。 　　 　　1.实验材料 　　 　　1.1药物 　　 　　所有药物均购自福建中医学院国医堂。药物按重量比加8倍量水浸泡0.5h，文火煎煮2次，第1次40min，第2次30min，合并2次水煎液，3500r/min离心15min，倒出上清液，70℃恒温水浴浓缩至每mL药液含生药1g，高压灭菌后4℃冰箱储存备用。 　　方药组成为：固表解毒合剂：生黄芪30g，金银花15g，鱼腥草15g，生甘草3g；处方2：鱼腥草15g，野菊花6g，茵陈15g，佩兰10g，草果3g；处方5：生黄芪10g，白术6g，防风10g，苍术6g，藿香10g，沙参lOg，金银花10g，绵马贯众6g。 　　 　　1.2毒株 　　 　　流感病毒株A/Fuzhou/84/2005(H3N2)，由福州市疾病预防控制中心保存。 　　 　　1.3细胞 　　 　　MDCK细胞(狗肾细胞)引自国家流感中心，本室传代保存。 　　 　　1.4鸡胚 　　 　　9～11日龄胚蛋，由福州农工商公司马安鸡场提供。 　　 　　1.5红细胞 　　采集人“O”型血液，以生理盐水洗涤3次，配制成0.75％红细胞悬液备用。 　　 　　1.6试剂 　　MEM细胞生长液(Hyclon公司)，新生小牛血清(Hy-don公司)，10000U/mL青一链霉素。MEM细胞维持液不含新生小牛血清，其余同细胞生长液。 　　 　　2.方法 　　 　　2.1药物毒性测定 　　 　　2.1.1药物对MDCK细胞毒性测定　24孔板MDCK细胞长成单层后，吸弃上清，分别加入无血清的MEM液进行2倍系列稀释成不同浓度的药液。每稀释度重复4孔，每孔100μL，以MEM液作正常细胞对照，在37℃、5％CO2培养箱中培养72h，每日观察细胞病变(cytopathogenic effect，CPE)，记录结果。 　2.1.2药物对鸡胚毒性测定　将药物的倍比稀释液分别接种到9～11日龄鸡胚尿囊腔，每胚0.2mL。每一稀释度接种5个鸡胚，同时以hank’s液作为正常对照，33℃，孵育72h，观察鸡胚发育状况，以不引起鸡胚死亡的稀释度作为药物对鸡胚的无毒限量。 　　 　　2.2流感病毒半数感染量(ID50)测定 　2.2.1流感病毒TCID50测定病毒悬液以10倍递次稀释成不同稀释度，分别接种经hank’8液洗涤3次的MDCK单层细胞，每管接种0.2mL，每稀释度接种4孔细胞管。接种后33℃吸附1h，以hank’8液洗涤3次，加入细胞维持液，33℃培养，每日观察细胞病变(CPE)情况，???现3-4+CPE时收获。进行血凝试验。 　　2.2.2流感病毒EID50测定 病毒悬液以10倍递次稀释成不同稀释度，分别接种到9～11日龄鸡胚尿囊腔，每胚0.2mL。每一稀释度接种4个鸡胚，封口。33℃，孵育72h，收获尿囊液，进行血凝试验。 　　 　　2.3药物对流感病毒的抑制作用 　　2.3.1药物对MDCK细胞的保护作用　将药物用含IOOU青一链霉素的无菌hank’s液作系列倍比稀释后，与病毒悬液(滴度为100TCID50)等量混合，作用1h，接种到MDCK细胞，每管接种0.2mL，每稀释度接种4孔细胞管，同时设正常细胞对照、病毒对照和阳性药物对照，33℃孵育，每日观察细胞病变(CPE)情况，出现3-4+CPE时收获，进行血凝试验，阳性者为被感染的细胞。计算50％细胞不受感染的药物稀释