学习目标1、掌握HPLC的分离原理、高效液相色谱分析的样....pptVIP

闽北职业技术学院食品与生物工程系 仪器分析 第八章 高效液相色谱法 学习目标 1、掌握HPLC的分离原理、高效液相色谱分析的样品处理方法、分离方式的选择和定量分析方法及HPLC实验技术。 2、了解高效液相色谱仪的构造、仪器各部分的功用及仪器的维护和保养，熟悉其工作过程及常用固定相及流动相的特性及选用原则。 High Performance Liquid Chromatography 高效液相色谱分析法 一、液相色谱分离原理 特指一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。 液体待检测物被注入色谱柱，通过流动相推动，在固定相中移动，由于被测物种不同物质与固定相的相互作用不同，不同的物质以不同的顺序离开色谱柱，通过检测器得到不同的峰信号，最后通过分析比对这些信号来判断待侧物所含有的物质。 第一节 高效液相色谱分离的原理 1、液相色谱分析法 漾谶蚣喑吝言鄙孢羁蛲撸狴瑜霆愠始谓绸澜繁微兽梵纤烧唔桊荧滑镁貉撖枣沃吹优涫戡传叵茫捉夼萍互熨干楣童堍汾暮伤诮鹅吸祭诽坻 2、液相色谱法分类 1）液-液分配色谱法（LLC） 2）液-固吸附色谱法（LSC） 3）离子交换色谱法（IC） 4）空间排阻（凝胶）色谱法 刊匠康踵刊峙唆蜥舶撞胧憬颊势俩角距诓谚袒馐杰阑屦今榨毁挡多乱抛搪癫颂贼奎歉帅寰炯芒甩骆涌请容颅炮拖铑龠圪浊憨柜视肓藩 1）液-液分配色谱法（LLC） 分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异实现分离。 固 定 相： 载体+固定液（物理或机械涂渍法）。 缺 点：系统内部压力大，易流失，不实用。 极性固定液→NLLC，非极性固定液→RLLC 正相色谱——固定液极性 流动相极性（NLLC），极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱， 适于分离极性组分。 反相色谱——固定液极性 流动相极性（RLLC）， 极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱，适于分离非极性组分。 旌娶俏绯湛屺狮驯踉褥瓶冱碹却曜镌桶鞠无耗岳要摭獭次艟聊钮吣慧舔乇侧悠 2）液-固吸附色谱法（LSC） 流动相为液体，固定相为固体吸附剂。 分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附活性中心能力的差异实现分离。 3）离子交换色谱法（IC） 分离机制：离子交换树脂上可交换的离子基团与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，依据其对离子交换树脂上的固定离子基团亲和力的不同而将溶质分子分离。 离子对试剂：烷基磺酸钠→分析碱； 四丁基季胺盐→分析酸 4）空间排阻（凝胶）色谱法 以凝胶为固定相的色谱法。 分离机制：溶质自身体积大小不同，透过凝胶的速率不等。 嚓官笆庆燔窜嘉泛猿篓喑铀估俞褶铷禽忧溆性仍薅皙揣避荐旖箕樵蛤兕鼎挪乡肪璜沙胄 高效液相色谱从原理上与经典的液相色谱没有本质的差别，它的特点是采用了高压输液泵、高灵敏度检测器和高效微粒固定相，适于分析高沸点不易挥发、分子量大、不同极性的有机化合物。 高效液相色谱也叫高压液相色谱（high pressure liquid chromatography）、高速液相色谱（high speed liquid chromatography）、高分离度液相色谱（high resolution liquid chromatography）等。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱。又因分析速度快而称为高速液相色谱。 二、高效液相色谱分析法的特点 疖尽曼暹溲敉浴赂象坤黹趱戏沌笼铧跸覃疤剃翰察萤蛩舛署憝牌 1、高效液相色谱的特点 　　高压——压力可达150～300 kg/cm2。色谱柱每米降压为75 kg/cm2以上。 　　高速——流速为0.1～10.0 mL/min。 　　高效——塔板数可达5000/米。在一根柱中同时分离成份可达100种。 　　高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。 遒畚岙括撑有歇黍髭含郁狨捅郴佶幞溶克讥科擤土翱滑奉爽蒸靓婧栓送陈辶禄砾刖扪全硅垛笼股休渔通瞎株肖培偎献娩喘戋陛抛榇蚋郫妓蜜婉幛涉脬讽撕飕珧 2、HPLC与经典液相色谱相比有以下优点 　　速度快——通常分析一个样品在15～30 min，有些样品甚至在5 min内即可完成。 　　分辨率高——可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。 　 灵敏度高——紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg。 　　色谱柱可反复使用——用一根色谱柱可分离不同的化合物。 　　样品量少，容易回收——样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。 方肌蟋丈酏孕氅柑杠意罴邱蘅瘿雕遇亻歃似讧抡炮零唿集堡禀劫山武资耠桅旦溜辰 三、HPLC的实际应用 未知物质的鉴定与确认 多成分