第五章 层析.ppt

图是两相邻组份在不同色谱条件下的分离情况。a）中两组份没有完全分离。b）和c）中两组份完全分离，前者的柱效虽不高，但选择性好；后者的选择性较差，但柱效高。 1.5 分离度 由此可见，单独用柱效或柱选择性并不能真实地反映组份在色谱柱中的分离情况，所以，在色谱分析中，需要引入分离度(Rs)这一概念. 概念：分离度也称分辨度。它是指相邻两色谱保留值之差与两峰底宽平均值之比。 当Rs 1时，两峰总有部分重叠； 当Rs =1时，两峰能明显分开； 当Rs 1时，两峰才能完全分离。 当然，更大的Rs值，分离效果会更好，但会延长分析时间。 2.1 凝胶过滤层析 1)原理与操作 凝胶过滤层析（GFC）是利用凝胶粒子为固定相，是根据料液中溶质相对分子质量的差别进行分离的液相层析法，具有分子筛的作用。 第二节 层析的类型及其原理 操作与原理：含有不同组分的溶液，通过网状结构的凝胶粒子，小分子扩散进入凝胶相，大分子被排阻于凝胶相外，加入洗脱剂后溶液向下推移，大分子及剩余的小分子进入下层新的凝胶相中，重复上述扩散和排阻。这样最先流出的为最大的分子，最后流出的为最小分子，分段收集可以获得按分子量大小分布的各组分。 b.凝胶特性参数 ⑴排阻极限：不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的相对分子质量。 如，Sephadex G50的排阻极限为30kD 4)凝胶过滤层析特点 操作简便,凝胶过滤介质相对价廉易得,适用于大规模分离纯化过程。因此，GFC在 生物大分子的分离纯化过程中最为普遍，尤其被广泛应用于分离纯化的初级阶段及最后成品化前的脱盐。 优点： ⑴溶质与介质不发生任何形式的相互作用,因此可采用恒定洗脱法洗脱展开，操作条件温和，产品收率可接近100%。 ⑵每批分离操作结束后不需要进行介质的清洗或再生，故容易实施循环操作，提高产品纯度。 ⑶作为脱盐手段，GFC比透析法速度快，精度高；与超滤法相比，剪切应力小，蛋白质活性收率高。 ⑷分离机理简单，操作参数少，容易规模放大。 (5)操作简便，介质价廉易得；适合于大规模生产back 2.2 离子交换层析 1)原理与操作 离子交换层析(IEC)： 利用离子交换剂为固定相，根据荷电溶质与离子交换剂之间静电相互作用力的差别进行溶质分离的洗脱层析方法; 原理：荷电溶质在离子交换剂上的分配系数； 意义：对于蛋白质和氨基酸，调节I；调节|pH-pI|； 阳离子交换树脂：CM-纤维素（羧甲基纤维素），交换功能基团为氨基（－NH3+)，分离带正电荷的蛋白质。 阴离子交换树脂：DEAE－纤维素（二乙胺乙基纤维素），交换功能基团为羧基（－COO－)，分离带负电荷的蛋白质。 操作：层析操作多采用线性梯度法和逐次洗脱法，其特点： ⑴线性梯度洗脱法： 由于恒定洗脱缺点有洗脱体积大,溶质洗脱不尽 线性梯度洗脱法 优点：流动相离子强度连续增大，不出现干扰峰，操作范围广； 缺点：需要特殊的浓度梯度的设备，重复性差。 ⑵逐次洗脱法（梯度洗脱）： 优点：利用切换不同盐浓度的流动相溶液进行洗脱，不需要特殊梯度设备，操作简便； 缺点：因为流动相浓度不连续变化，容易出现干扰峰。此外，容易出现多组分洗脱峰重叠的现象，因此洗脱操作参数的设计比较困难。 操作：低盐结合，高盐洗脱，吸脱时，增加溶液的I，如改变pH，增加盐浓度，离子被取代而解吸下来back 2.3 疏水性相互作用层析 1)原理 疏水性相互作用层析(HIC)是基于物质分子的疏水性基团与层析介质上的疏水基团相互作用在非极性的固定相和极性的流动相之间不断分配得以分离 首要条件：载体的活化与配基的偶联. 3)HIC操作:高盐结合,低盐洗脱 影响因素: a.离子强度以及种类 离子强度↑，HIC吸附↑，所以，降低盐浓度，增加流动相的极性来减少疏水作用，以利洗脱。 什么是色谱分离技术？ 色谱分离技术的分类？ 什么是色谱柱的理论塔板数以及如何计算理论塔板数？ * * * * * * * * * * * * 第五章 层析 背景 色谱法也称色层法，是1906年俄国植物学家Michael Tswett发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为“色谱法”（Chromatography) 。 后来无色物质也可利用吸附柱色谱分离。 英国生物学家Martin和Synge。他们首先提出了色谱塔板理论，以及其远见卓识的预言。 1944年出现纸色谱以后，色谱法不断发展，相继出现薄层色谱、亲和色谱、凝胶色谱、气相色谱、高压液相色谱（HPLC）等。 第一节 层析的理论基础 1.1 层析原理 色谱法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（