微生物实验(污泥中细菌和抗Cu离子的细菌的总数测定_金属抗性细菌的分离、纯化、保存以及菌落形态观察)..docVIP

环境工程微生物学 实验方案 实验题目： 污泥中细菌总数测定和抗Cu细菌的分离、纯化、保存以及菌落形态观察 组长：XXX 组员： ＸＸＸ ＸＸＸ ＸＸＸ ＸＸＸ  实验目的 学习污泥样品的采取方法和污泥样品细菌总数测定的方法。 了解平板菌落计数法的原则。 熟悉玻璃器皿的洗涤和灭菌前的准备工作。 了解配制微生物培养基的基本原理，掌握常规的配制、分装培养基的方法。 学会各类物品的包装、配制和灭菌技术。 从污泥中分离、培养微生物，掌握常用的分离微生物的方法。 学会接种技术。 观察分离出来的几种细菌的个体形态及与其相应的菌落形态特征。 二、实验原理 1、测细菌总数原理：微生物活体数量的测定方法，常用平板培养计数法。它是通过将样品制成均匀的一系列不同稀释度的稀释液，再取一定的稀释液接种，使其均匀分布于培养皿中特定的培养基内，最后根据在平板上长出的菌落数计算出每克（或m）样品中的活菌数量。 微生物的接种 恒温培养箱、高压蒸气锅、电子天平、牛肉膏蛋白胨琼脂培养基； 灭菌的玻璃塞瓶1个，三角烧瓶/烧杯4个，灭菌培养皿9个，1ml移液管6支、10ml 2支、试管3支，PH试纸、玻璃棒、记号笔1支,100ml量筒，滴管2支。 2、分离纯化 （1）样品：污泥 （2）仪器：高压蒸汽灭菌器、干燥箱、酒精灯或煤气灯、稀释水、试管、刻度移液管、锥形瓶、烧杯、量筒、滴管、吸水纸、镊子、搪瓷杯、高温灭菌锅、移液枪（枪头）、药物天平、玻璃棒、玻璃珠、石棉网、药匙、铁架、表面皿、滤纸、pH试纸和棉花、接种环、酒精灯、恒温培养箱、4大类菌落（培养皿） （3）试剂或材料：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、NaOH和琼脂、Cu离子试剂等 四、操作步骤 1. 玻璃器皿的准备 （1）洗涤 玻璃器皿在使用前必须洗涤干净。培养皿、试管、锥形瓶等可用洗衣粉加去污粉洗刷并用自来水冲净。移液管先用洗液浸泡，再用水冲洗干净。洗刷干净的玻璃器皿自然晾干或放入干燥箱中烘干、备用。 （2）包装 A.移液管的包装：移液管的吸端用细铁丝（或牙签）将少许棉花塞入构成1-1.5cm长的棉塞，起过滤作用（以防细菌吸入口中，并避免将口中细菌吹入管内）。棉塞要塞的松紧适宜，吸时既能通气，又不致使棉花滑入管内。然后将塞好棉花的移液管的尖端，放在4-5cm宽的长纸条的一端，移液管与纸条约成30度夹角，折叠包装纸包住移液管的尖端，用左手将移液管压紧，在桌面上向前搓转，纸条螺旋式地包在移液管外面，余下的纸折叠打结，待灭菌。 B.培养皿的包装：培养皿由一底一盖组成一套，用牛皮纸或报纸将8套培养皿（皿底朝里，皿盖朝外，4套、4套相对而放）包好。 2. 培养基的配制 （1）配制溶液 取一定容量的烧杯盛入100mL蒸馏水（有时也可用自来水），按培养基配方（0.5g牛肉膏、1g蛋白胨、0.5gNaCl、2.0g琼脂、重金属Cu离子）逐一称取各种成分，依次加入水中溶解。蛋白胨、肉膏等可加热促进溶解，待全部溶解后，加水补足因加热蒸发的水量。在制备固体培养基加热融化琼脂时要注意搅拌，避免琼脂糊底烧焦。 （2）调节pH，再加琼脂 一般刚配好的培养基是偏酸性的，故要用质量浓度为100g∕L NaOH调pH至7.2-7.4.应缓慢加入NaOH，边加边搅拌，并不时用pH试纸测试。调整至所需的pH。 （3）分装 A.分装试管：将培养基趁热加至漏斗中。分装时左手并排地拿数根试管，右手控制弹簧夹，将培养基依次加入各试管，用于制造斜面培养基时，一般装量不超过试管高度（15mm*150mm）） 5．污泥样品的采取 取距污泥面10-15cm深层污泥样品，先将灭菌的带玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出，最好立即检查，否则需放入冰箱中保存。 6．细菌总数测定 （1）取加入9ml水的灭菌试管。取1ml污泥样品注入第一管9ml灭菌水内，摇匀，再自第一管取1ml至下一管灭菌水内，如此稀释到第三管，稀释度分别为10-1、10-2与10-3。一般中等污秽污泥样品，取10-1、10-2、10-3三个连续稀释度，污秽严重的取10-2、10-3、10-4三个连续稀释度。 （2）自最后一个稀释度的试管中各取1ml稀释水加入空的灭菌培养皿中，每一稀释度做两个培养皿。 （3）各倾注15ml已溶化并冷却至45℃左右的培养基，立即放在桌上混匀。 （4）凝固后倒置于37℃培养箱中培养24小时。 细菌的纯种分离及培养（平板表面涂布法） （1）取样：用无菌瓶从人工污泥中取一定量的污泥，迅速带回实验室。 （2）融化培养基：加热融化培养基，待用。 （3）稀释样品：将1瓶90ml和5管（根据预备实验数据变化）9mL的无菌水排列好，按10-1、10-2、10-